Μηχανισμός προσαρμογής των λιπιδίων του τροφογενούς παθογόνου βακτηρίου λisteria monocytogenes σε αντιοξειδωτικά και σε συνδυασμό με θερμοκρασία: pH και άλλες συνθήκες - συνέπειες στην ασφάλεια των τροφίμων

Abstract

The pathogen Listeria monocytogenes is present in a variety of food products and is a main reason for many outbreaks with high case fatality rates. Modification of its membrane lipid composition, and thus changes in cytoplasmic membrane fluidity, is an adaptation mechanism in L. monocytogenes, which allows it to grow in a stressful environment such as low temperature, low pH, presence of organic acids, etc. Aromatic plants [including oregano (Origanum vulgare L.)] are great sources of antioxidants and antimicrobial compounds for natural food preservation. The aim of this thesis was to determine if a water infusion of oregano is able to act as a natural antimicrobial agent against L. monocytogenes and the changes that will occur in its membrane lipids, during its adaptation of sub-lethal concentration of oregano infusion. For this purpose, this thesis was focused on three main directions. The first direction was concerned about the oregano infusion that was used in the experimental procedure (determination of total phenolic content, antioxidant ability and identification of phenolic compounds). The second direction was focused on the potential impact of this infusion on the survival of the bacterium a) in nutrient broth cultures and correlation of its action in other conditions of food preservation, such as low temperature (5°C) and acid pH (pH 5.5, acetic acid) and b) in a real food model, such as tomato juice, in two different storage temperatures (30 and 5°C). The third guideline was the study of membrane lipids of the bacterium under the influence of the infusion of oregano; in order to be explored one of its adaptation mechanisms (determination of the lipids proportion, fatty acids and membrane fluidity).The results demonstrated that the water infusion of oregano is rich in phenolic compounds (223.86±2.31mg gallic acid equivalents/100mL) and has strong antioxidant activity (12017.00±201.36 mg ascorbic acid equivalents/100mL). Some of the phenolic compounds were identificated such as luteolin, apigenin, methylapigenin, kaempferide, coumaric acid as O-glucuronide forms and rosmarinic acid. The infusion of oregano reduced the cells of L. monocytogenes in broth at very low levels, mainly when its presence was combined with refrigerator temperature or/and acetic acid (pH 5.5). The presence of oregano infusion reduced the inoculated cells of L. monocytogenes in pasteurized tomato juice at 5°C of storage (3.7log decline after 12 days, 65.3% decrease). The infusion of oregano had altered the fatty acid composition of L. monocytogenes by incorporation more straight fatty acids but fewer branched-chain fatty acids into its membrane, mainly when its presence was combined with acetic acid in pH 5.5 (303.8% increase and 33.8% decrease, respectively). The above changes in fatty acids composition of L. monocytogenes interpreted the reduced membrane fluidity, which was measured. The above results indicate that a water infusion of oregano could be used as a natural antimicrobial agent against L. monocytogenes, especially in an acidic food which will be stored at low temperature.

Το βακτήριο Listeria monocytogenes εμφανίζεται σε μια ποικιλία τροφίμων και έχει προκαλέσει πολλές ομαδικές τροφολοιμώξεις με υψηλά ποσοστά θνησιμότητας. Η τροποποίηση της σύστασης των μεμβρανικών λιπιδίων του και συνεπώς η μεταβολή της ρευστότητας της κυτταρικής μεμβράνης, είναι ένας μηχανισμός προσαρμογής που του επιτρέπει να αναπτύσσεται σε δυσμενείς συνθήκες, όπως χαμηλή θερμοκρασία, όξινο pH, παρουσία οργανικών οξέων κλπ. Τα αρωματικά φυτά [όπως η ρίγανη (Origanum vulgare L.)] είναι σπουδαίες πηγές αντιοξειδωτικών και αντιμικροβιακών ουσιών και μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως φυσικά συντηρητικά στα τρόφιμα.Σκοπός αυτής της διατριβής ήταν να εξεταστεί αν ένα υδατικό εκχύλισμα ρίγανης μπορεί να δράσει ως φυσικό αντιμικροβιακό ενάντια στο βακτήριο L. monocytogenes, καθώς κι οι αλλαγές που πραγματοποιούνται στα λιπίδια της μεμβράνης του, κατά τη προσαρμογή του σε ήπιες συγκεντρώσεις του εκχυλίσματος. Για το σκοπό αυτό, η μελέτη εστιάστηκε σε τρεις κύριες κατευθύνσεις. Η πρώτη κατεύθυνση αφορούσε την μελέτη του εκχυλίσματος της ρίγανης που χρησιμοποιήθηκε στην υπόλοιπη πειραματική πορεία (συνολικό περιεχόμενο φαινολικών συστατικών, αντιοξειδωτική ικανότητα και ταυτοποίηση φαινολικών ενώσεων). Η δεύτερη κατεύθυνση επικεντρώθηκε στην πιθανή επίδραση του εκχυλίσματος στην επιβίωση του βακτηρίου α) σε καλλιέργειες με θρεπτικό ζωμό και συσχέτιση της δράσης του και με άλλες συνθήκες συντήρησης των τροφίμων, όπως χαμηλή θερμοκρασία (5°C) και όξινο pH (pH 5,5, οξικό οξύ) και β) σε ένα μοντέλο πραγματικού τροφίμου, όπως είναι ο τοματοχυμός, σε δύο διαφορετικές θερμοκρασίες αποθήκευσής του (30 και 5°C). Η τρίτη κατεύθυνση ήταν η μελέτη των λιπιδίων της κυτταρικής μεμβράνης του βακτηρίου υπό την επίδραση του εκχυλίσματος ρίγανης, ώστε να διερευνηθεί ένας από τους μηχανισμούς προσαρμογής του (προσδιορισμός του ποσοστού των λιπιδίων, των λιπαρών οξέων και της ρευστότητας της μεμβράνης).Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το υδατικό εκχύλισμα ρίγανης είναι πλούσιο σε φαινολικές ενώσεις (223,86±2,31 mg ισοδύναμα γαλλικού οξέος/100mL) και εμφανίζει υψηλή αντιοξειδωτική ικανότητα (12017,00±201,36 mg ασκορβικού οξέος/100mL). Ταυτοποιήθηκαν ορισμένες φαινολικές ουσίες, όπως λουτεολίνη, απιγενίνη, μεθυλαπιγενίνη, kaempferide, κουμαρικό οξύ σε Ο-γλυκουρονικές μορφές καθώς και ροσμαρινικό οξύ. Το υδατικό εκχύλισμα ρίγανης μείωσε τον πληθυσμό του βακτηρίου σε θρεπτικό μέσο σε πολύ χαμηλά επίπεδα, κυρίως όταν η παρουσία του συνδυάστηκε με θερμοκρασία ψυγείου (5°C) ή/και με οξικό οξύ (pH 5,5). Επίσης μείωσε τον πληθυσμό του βακτηρίου που ενοφθαλμίστηκε σε παστεριωμένο χυμό τομάτας κατά την αποθήκευση σε 5°C, κατά 3,7log κυττάρων/g (65,3%) μετά από 12 ημέρες αποθήκευσης. Το εκχύλισμα της ρίγανης τροποποίησε τη σύσταση των λιπαρών οξέων του βακτηρίου, εισάγοντας περισσότερα λιπαρά οξέα ευθείας αλυσίδας και λιγότερα διακλαδισμένα, κυρίως όταν η παρουσία του συνδυαστεί με οξικό οξύ σε pH 5,5 (303,8% αύξηση και 33,8% μείωση, αντίστοιχα). Οι παραπάνω αλλαγές στα λιπαρά οξέα του βακτηρίου, ερμηνεύουν και την μείωση της ρευστότητας της κυτταρικής μεμβράνης του που παρατηρήθηκε. Τα παραπάνω αποτελέσματα δείχνουν, ότι ένα υδατικό εκχύλισμα ρίγανης θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί ως φυσικό αντιμικροβιακό ενάντια στο βακτήριο L. monocytogenes, ειδικά σε ένα όξινο τρόφιμο, το οποίο θα αποθηκευτεί σε χαμηλή θερμοκρασία.