Μελέτη μορίων που παίζουν σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη των πρωτόζωων Leishmania και Trypanosoma

Abstract

Leishmania spp., Trypanosoma brucei and Trypanosoma cruzi are trypanosomatid protozoan parasites that cause leishmaniasis, Human African Trypanosomiasis (HAT) and American Trypanosomiasis (Chagas Disease) respectively. These neglected tropical diseases cause considerable morbidity and mortality worldwide. Currently there are no effective human vaccines for their prevention, whereas chemotherapy is often ineffective or toxic. For this reason, the discovery of new antiparasitic agents is of prime importance. It is imperative that the rational design of new medicines focuses on both the identification of candidate parasite targets that their inhibition affect parasite viability or virulence and the design of such inhibitors based on Structure-Activity Relationship (SAR) studies. Overall this strategy is anticipated to lead to an effective rational drug design. The search for drug targets requires a multidisciplinary approach. The completion of the genome project of many trypanosomatid species gives a vast amount of new information that can be exploited for the identification of putative drug candidates with a prediction of “druggability” based on their divergence from the mammalian host proteins. This thesis focuses on important parasite proteins that could constitute putative molecular drug targets for the treatment of leishmaniasis and HAT, because the inhibition of their activity is expected to modulate virulence and cell-cycle progression. Special emphasis is given on Glycogen Synthase Kinase 3 (GSK-3) and the cdc2-related kinase 3 (CRK3). A number of indrirubin analogues (a natural bis-indole present in mollusks and plants), that target these kinases by binding in the ATP-binding pocket, have potent anti-parasitic and parasite-specific activity. Their mode of action suggests important differences in the active sites between these Leishmania and T. brucei kinases, but also between the parasitic kinases and their human homologues. At the same time, these inhibitors were tested for their activity against Τ. cruzi parasites in vitro and in vivo. Finally, one inhibitor was found to be promising against Chagas disease in Balb/C mice while two GSK-3 inhibitors were found to have promising activity in both the acute and chronic phase of visceral leismaniasis in the Balb/C experimental model. The above results could contribute to the search of potent drugs that could be exploited in a combined treatment schema for the above diseases or/and enhance the study of the in vivo mechanisms of action of the GSK-3 inhibitors. Overall, the results described above contribute to the concentrated international efforts towards the development of targeted drugs focusing on the kinome for the treatment of leishmaniasis, HAT and Chagas disease.

Τα πρωτόζωα Leishmania spp., Trypanosoma brucei και Trypanosoma cruzi ανήκουν στις τρυπανοσωματίδες και είναι παράσιτα που προκαλούν τις ασθένειες λεϊσμανίαση, Ανθρώπινη Αφρικανική Τρυπανοσωμίαση (ΗΑΤ) και Αμερικανική Τρυπανοσωμίαση (Νόσος του Chagas), αντίστοιχα. Αυτές οι παραμελημένες ασθένειες προκαλούν σημαντική νοσηρότητα και υψηλά ποσοστά θνησιμότητας παγκοσμίως. Μέχρι σήμερα, δεν έχουν ανακαλυφθεί αποτελεσματικά εμβόλια για τον άνθρωπο για την πρόληψη των ασθενειών αυτών, ενώ η χημειοθεραπεία είναι συχνά αναποτελεσματική ή/και τοξική και έχει υψηλό κόστος. Για το λόγο αυτό, είναι επιτακτική ανάγκη εύρεσης καινούριων και ιδανικότερα στοχευμένων χημειοθεραπειών. Παράλληλα, η αναζήτηση ιδανικών υποψήφιων παρασιτικών παραγόντων όπου η στόχευση τους να αναστέλλει επιλεκτικά τη διαφοροποίηση και ανάπτυξη των τρυπανοσωματίδων είναι μείζονος σημασίας. Τα παραπάνω αναμένεται να οδηγήσουν στον ορθολογικό σχεδιασμό καινούριων φαρμάκων. Η ολοκλήρωση της χαρτογράφησης του γονιδιώματος πολλών ειδών των τρυπανοσωματίδων μας παρέχει πλούτο γνώσης που μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την αναγνώριση των ιδανικών στόχων και των αντίστοιχων υποψήφιων φαρμάκων. Τα φάρμακα αυτά στη συνέχεια πρέπει να επιλεχθούν έτσι ώστε να εμφανίζουν επιλεκτικότητα έναντι των παρασιτικών πρωτεϊνών αντί των πρωτεϊνών του θηλαστικού ξενιστή. Στην παρούσα διατριβή, επικεντρωθήκαμε στη μελέτη σημαντικών πρωτεϊνών των παρασίτων, και μοριακών στόχων φαρμάκων για τη θεραπεία της λεϊσμανίασης και της ΗΑΤ, που παίζουν σημαντικό ρόλο στην εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου και στη βιωσιμότητα του παρασίτου. Πιο συγκεκριμένα, επικεντρωθήκαμε στην μελέτη της κινάσης της συνθετάσης του γλυκογόνου 3 (GSK-3) και της cdc2-σχετιζόμενης κινάσης 3 (CRK3). Μια βιβλιοθήκη χημικών αναστολέων που απαρτίζεται από ανάλογα ιντιρουμπίνης (μια δις-ινδόλη που απαντάται σε μαλάκια και φυτά), τα οποία στοχεύουν τις αντίστοιχες κινάσες των θηλαστικών δρώντας ως ATP-ανταγωνιστικοί αναστολείς, βρέθηκε να έχουν ισχυρή αντιπαρασιτική δράση. Ο τρόπος δράσης των αναλόγων αυτών υποδηλώνει σημαντικές διαφορές στο ενεργό κέντρο της κινάσης GSK-3 των παρασίτων Leishmania και Τ. brucei, αλλά και σε σχέση με την ομόλογη ανθρώπινη GSK-3. Ταυτόχρονα, οι αναστολείς αυτοί δοκιμάστηκαν για την δράση τους έναντι των παρασίτων Τ. cruzi τόσο in vitro όσο και in vivo. Τέλος, ένας αναστολέας βρέθηκε να είναι πολλά υποσχόμενος έναντι της νόσου του Chagas σε ποντικούς Balb/c ενώ δύο αναστολείς της λεϊσμανιακής GSK-3 βρέθηκαν να έχουν υποσχόμενη δραστικότητα στην οξεία και στη χρόνια φάση της σπλαχνικής λεϊσμανίασης σε πειραματικό μοντέλο ποντικού Balb/C. Η περαιτέρω μελέτη της in vivo δράσης των αναστολέων αυτών μπορεί να βοηθήσει στην διαλεύκανση του μηχανισμού δράσης των αναστολέων της GKS-3 ή/και να χρησιμεύσει στην ανάπτυξη μιας συνδυαστικής θεραπείας εναντίον της λεϊσμανίασης και της αμερικάνικής τρυπανοσωμίασης. Συνοπτικά, τα αποτελέσματα που περιγράφονται παραπάνω συμβάλλουν στην ανάπτυξη ανακάλυψης στοχευμένων φαρμάκων έναντι των παρασιτικών κινασών για τη θεραπεία της λεϊσμανίασης, της ΗΑΤ και της νόσου του Chagas.