Διερεύνηση της επίδρασης φυσικών προϊόντων, προερχόμενων από φυτά της ελληνικής χλωρίδας στο μεταβολισμό των οστών

Abstract

The purpose of this thesis was the phytochemical analysis and pharmacological study of extracts and isolated compounds derived from plants of the Greek flora, in order to discover natural products with beneficial effects in osteoporosis. The main selection criteria of the plants involved were: a) the evaluation of information found in scripts of Ancient Greek authors-therapists (Dioscorides, Hippocrates, Theophrastos etc), b) the study of current bibliographical data which were searched both in ethnopharmacological scripts as well as in manuscripts published in international scientific journals and c) the use of data correlated with plants of the Greek flora and refer to their morphological characteristics, endemicity, rareness etc. Taking into account the results of the evaluation of the aforementioned information and scientific data, 85 plant material, which after their harvesting and drying where extracted mainly with accelerated extraction and ultrasound extraction methods. Therefore 169 plant extracts were prepared and initially evaluated as to their chemical composition with the use of methods such as high performance thin layer chromatography (HPTLC) and high performance liquid chromatography (HPLC). Based on the extract phytochemical profile, the most interesting were selected for evaluation of their estrogen/antiestrogen and osteoprotective activity. The estrogen/antiestrogenactivity was evaluated against human endometrial adenocarcinoma cells (Ishikawa) which have the ability to produce alkaline phosphatase activity under the influence of estrogens. The extracts which showed significant estrogen and/or anti-estrogen activity in the aforementioned cell line were tested for their ability to affect the proliferation and viability of human breast adenocarcinoma cells (MCF-7). The Ishikawa and MCF-7 cell lines are used for the recognition of compounds withestrogen/antiestrogen properties and are a very credible model and it is thought that they represent For the determination of the osteoprotective properties of the extracts we used preosteoblastic cells (MC3T3-Ε1) capable of differentiating to mature osteoblasts, which has been documented by measurement of alkaline phosphatase expression. Alkaline phosphatase is anenzyme which is produced and secreted by osteoblasts in their initial maturation phase. The results of the assays showed a series of extracts as potential osteoprotective agents, which involve the EtOAc and methanolic extract of the roots of the species Iris germanica (Iridaceae). Subsequently using various chromatographic techniques we isolated 26 secondary metabolites which have been identified through spectral techniques (1D and 2D NMR, HRMS). These compounds belong to the chemical categories of iridal, isoflavonoids, acetophenones, benzophenones and xanthones. The isolated metabolites has been evaluated as potential osteoprotective agents through their ability to promote differentiation of primal osteoblasts (MC3T3-E1 cells) and/or suppress the differentiation of macrophages cells (RAW264.7) to mature osteoclasts. Their estrogenicity was also determined through the promotion of alkaline phosphatase expression in Ishikawa cells aswell as proliferation of MCF-7. Furthermore these compounds are also found in other species of Iris genus which have been also studied in this thesis and they showed potential osteoprotective activity. So, we decidedto evaluate in vivo the methanolic extract of the roots of Iris unguicularis subsp. cretensis, on bonemass loss of the ovariectomized (OVX) rat experimental model of osteoporosis. The selection of this extract was based on the fact that there was a sufficient amount of the plant for the production of the extract although that, the plant I. unguicularis subsp. cretensis is an endemic Greek plant. The experimental procedures lasted for six months as the determination of bone mineral density of the left tibia of the experimental animals through DEXA method was done at the beginning as well as at the third and sixth month. For the duration of the experiment the body weight of rats was measured and at the point of euthanasia the weight of their vital organs, also. In addition the femurs were subjected to ex vivo three point bending test, in order to determine the mechanical properties and the strength of bones and the right tibia in topographical measurements with pQCT method for the determination of their geometry and quality.

Αντικείμενο της παρούσας διδακτορικής διατριβής αποτέλεσε η φυτοχημική ανάλυση και φαρμακολογική μελέτη εκχυλισμάτων και απομονωμένων ενώσεων, προερχόμενων από φυτά της ελληνικής χλωρίδας, με σκοπό την ανακάλυψη φυσικών προϊόντων με ευεργετικές επιπτώσεις στην οστεοπόρωση. Οι βασικοί άξονες επιλογής των εμπλεκόμενων φυτικών ειδών ήταν: α) η αξιολόγηση πληροφοριών οι οποίες ανευρέθηκαν σε κείμενα των Αρχαίων Ελλήνων συγγραφέων θεραπευτών (Διοσκουρίδης, Ιπποκράτης, Θεόφραστος κ.ά.), β) η μελέτη σύγχρονων βιβλιογραφικών δεδομένων, τα οποία αναζητήθηκαν τόσο σε συγγράμματα παραδοσιακής θεραπευτικής, όσο και σε εργασίες δημοσιευμένες σε διεθνή επιστημονικά περιοδικά και γ) η αξιοποίηση δεδομένων τα οποία σχετίζονται με φυτικά είδη της ελληνικής χλωρίδας και αναφέρονται στην περιγραφή των μορφολογικών χαρακτηριστικών τους, τον ενδημισμό τους, την σπανιότητα, τον κίνδυνο εξαφάνισης τους κ.ά. Με βάση τα αποτελέσματα της αξιολόγησης των προαναφερόμενων πληροφοριών και σύγχρονα επιστημονικά δεδομένα επιλέχθηκαν 85 φυτικές δρόγες, οι οποίες μετά τη συλλογή και την ξήρανσή τους εκχυλίστηκαν κυρίως με τις τεχνικές της επιταχυνόμενης εκχύλισης και της υποβοηθούμενης με υπερήχους εκχύλισης. Έτσι, παρασκευάστηκαν 169 φυτικά εκχυλίσματα, τα οποία αξιολογήθηκαν αρχικά ως προς το χημικό τους περιεχόμενο, με τη χρήση των τεχνικών της χρωματογραφίας λεπτής στιβάδας υψηλής απόδοσης (HPTLC) και της υγρής χρωματογραφίας υψηλής απόδοσης (HPLC).Βασιζόμενοι στο φυτοχημικό προφίλ των παραγόμενων εκχυλισμάτων επιλέχθηκαν τα πλέον ενδιαφέροντα για να αξιολογηθούν ως προς την οιστρογόνο/αντιοιστρογόνο και οστεοπροστατευτική δραστικότητά τους. Ο έλεγχος της οιστρογόνου / αντιοιστρογόνου δράση ςτων επιλεγμένων εκχυλισμάτων πραγματοποιήθηκε σε κύτταρα ανθρώπινου αδενοκαρκινώματος ενδομητρίου (Ishikawa), τα οποία έχουν την ικανότητα να παράγουν πλακούντια αλκαλική φωσφατάση, υπό την επίδραση οιστρογόνων ουσιών. Τα εκχυλίσματα που παρουσίασαν καλή οιστρογόνο ή/και αντιοιστρογόνο δράση στην προαναφερόμενη κυτταρική σειρά ελέγχθηκαν ως προς την ικανότητάς τους να επηρεάζουν των πολλαπλασιασμό και τη βιωσιμότητα ανθρώπινων κυττάρων αδενοκαρκινώματος μαστού (MCF-7). Οι κυτταρικές σειρές Ishikawa και MCF-7 χρησιμοποιούνται ευρύτατα για την ανεύρεση ενώσεων με οιστρογονικές / αντιοιστρογονικές ιδιότητες και αποτελούν ένα πολύ αξιόπιστο μοντέλο, μιας και θεωρείται ότι αναπαριστούν invitro την απόκριση σε οιστρογόνα και αντιοιστρογόνα των καρκινικών επιθηλιακών κυττάρων της μήτρας και του μαστού, αντίστοιχα.Για τον προσδιορισμό των οστεοπροστατευτικών ιδιοτήτων των παρασκευασμάτων,χρησιμοποιήθηκαν πρώιμα οστεοβλαστικά κύτταρα (MC3T3-Ε1) ικανά να διαφοροποιούνται σε ώριμους οστεοβλάστες. Η διαφοροποίηση σε ώριμους οστεοβλάστες τεκμηριώθηκε με τη μέτρηση της έκφρασης της αλκαλικής φωσφατάσης, ενζύμου το οποίο παράγεται και εκκρίνεται από τους οστεοβλάστες στο αρχικό στάδιο ωρίμανσής τους.Τα αποτελέσματα των προαναφερόμενων ελέγχων ανέδειξαν μια σειρά εκχυλισμάτων ως πιθανούς οστεοπροστατευτικούς παράγοντες, μεταξύ των οποίων το εκχύλισμα EtOAc και το μεθανολικό εκχύλισμα των ριζών του είδους Iris germanica (οικ. Iridaceae) επέδειξαν όχι μόνο αξιόλογες βιολογικές ιδιότητες, αλλά και αξιοσημείωτο φυτοχημικό προφίλ. Στη συνέχεια, με την εφαρμογή διαφόρων χρωματογραφικών τεχνικών (φυγόκεντρος χρωματογραφία κατανομής,χρωματογραφία μοριακού αποκλεισμού, παρασκευαστική χρωματογραφία λεπτής στιβάδας)επιτεύχθηκε ο εντοπισμός 26 δευτερογενών μεταβολιτών. Με τη χρήση φασματοσκοπικών τεχνικών (1D και 2D NMR, HRMS) πραγματοποιήθηκε η ταυτοποίηση και ο πλήρης χαρακτηρισμός των φασματοσκοπικών χαρακτηριστικών 23 απομονωμένων ενώσεων, οι οποίες ανήκουν στις κατηγορίες των ιριδαλών, ισοφλαβονοειδών, ακετοφαινονών, βενζοφαινονών και ξανθονών.Οι απομονωμένοι μεταβολίτες αξιολογήθηκαν ως δυνητικά οστεοπροστατευτικοί παράγοντες μέσω προσδιορισμού της ικανότητά τους να επάγουν τη διαφοροποίηση πρώιμων οστεοβλαστών (προ-οστεοβλαστικά κύτταρα MC3T3-E1) ή/και να καταστέλλουν τη διαφοροποίηση μακροφάγων κυττάρων σε οστεοκλαστών (μακροφάγα κύτταρα RAW264.7). Επίσης, προσδιορίστηκε η οιστρογονικότητά τους μέσω επαγωγής της έκφρασης της αλκαλικής φωσφατάσης στα κύτταρα Ishikawa, καθώς και του πολλαπλασιασμού των κυττάρων MCF-7 και εντοπίσθηκαν οι ενώσεις οι οποίες είναι υπεύθυνες για τις αξιόλογες ιδιότητες των αρχικών φυτικών παρασκευασμάτων.Ωστόσο, δεν είναι τυχαίο το γεγονός ότι οι ενώσεις αυτές αποτελούν δευτερογενείς μεταβολίτες και των άλλων ειδών του γένους Iris, τα οποία μελετήθηκαν στα πλαίσια της παρούσης μελέτης και επέδειξαν οστεοπροστατευτικές ιδιότητες. Επομένως, κρίθηκε σκόπιμη ηin vivo αξιολόγηση του μεθανολικού εκχυλίσματος των ριζών του είδους Iris unguicularis subsp. cretensis ως προς την επίδρασή του στη διατήρηση της οστικής πυκνότητας σε μοντέλο θήλεος ωοθηκεκτομημένου επίμυος (μοντέλο οστεοπόρωσης). Η επιλογή του συγκεκριμένου εκχυλίσματος βασίσθηκε κυρίως στο γεγονός ότι υπήρχε διαθέσιμη η απαιτούμενη ποσότητα φυτικού υλικού για την παρασκευή του εκχυλίσματος, παρόλο που το φυτό I. unguicularis subsp.cretensis αποτελεί ενδημικό είδος της ελληνικής χλωρίδας. Η πειραματική διαδικασία διήρκεσε έξι μήνες και προσδιορίστηκε η οστική πυκνότητα της αριστερής κνήμης των πειραματοζώων με τη μέθοδο DEXA κατά την έναρξη του πειράματος, καθώς και τον 3ο και 6ο μήνα. Καθ’ όλη τη διάρκεια του πειράματος πραγματοποιούνταν μετρήσεις του βάρους των επίμυων και κατά την ευθανασία, προσδιορίστηκε το βάρος των ζωτικών τους οργάνων. Επιπρόσθετα, τα μηριαία οστά υποβλήθηκαν σε ex vivo δοκιμασία καταπόνησης τριών σημείων, για να προσδιοριστεί η ανθεκτικότητα των οστών και οι δεξιές κνήμες σε τοπογραφικές μετρήσεις με τη μέθοδο pQCTγια τον προσδιορισμό της γεωμετρίας και της ποιότητάς τους.