Ανάπτυξη πειραματικού εμβολίου εναντίον ενδοκυτταρικών παθογόνων

Abstract

Leishmaniasis is a group of diseases caused by intracellular parasites of the genus Leishmania, displaying a spectrum of clinical manifestations from self-healing cutaneous to the life-threatening visceral form of the disease. The disease is prevalent in large areas of tropical, subtropical and the Mediterranean countries. Available chemotherapy is far from satisfactory, as existing drugs need multiple injections, have many side effects and practically show limited efficacy in some endemic areas due to the development of resistant parasites. Hence, there is an urgent need to develop an effective vaccine against leishmaniasis. Peptide and protein vaccines lack strong immunogenicity and thus require the use of an adjuvant. However, adjuvants may develop side effects and for that reason, microparticulate and nanoparticulate formulations are currently considered as ideal vaccine delivery systems. The aim of the present study was to investigate the ability of poly(lactic-co-glycolic) acid (PLGA) nanoparticles (NPs) to induce protection against experimental visceral leishmaniasis. Nanoformulations based on PLGA NPs were synthesized and encapsulated a crude mix of proteins from Leishmania infantum promastigotes (sLiAg) and MPLA, as adjuvant. PLGA NPs were surface-modified with a synthetic 8-peptide mimicking the TNFα docking region, in order to enhance dendritic cell targeting. Surface modified PLGA NPs were taken up more efficiently from dendritic cells compared to non-modified NPs. This is attributed to possible enhancement of dendritic cell targeting, as well as to the reduction of the absolute value of z potential. Incorporation of sLiAg and/or MPLA and surface modification with p8 induced the maturation and functional differentiation of dendritic cells, characterized by increased expression of surface molecules and intracellular production of cytokines, resulting in their enhanced ability of presenting parasitic antigens and activating in vitro T cells. Vaccination of BALB/c mice with PLGA-sLiAg-MPLA or p8-PLGA-sLiAg NPs induced significant reduction of parasite burden and development oflong-lasting immunity against L. infantum infection. Development of immunity was due to activation of T helper and cytotoxic T cell populations and simultaneous suppression of TH2 and regulatory T cell subpopulations. Based on the above results, the nanoformulations used are suggested as candidate vaccines against visceral leishmaniasis.

Με τον όρο λεϊσμανίαση περιγράφεται ένα σύμπλεγμα ασθενειών που προκαλείται από τα ενδοκυτταρικά παράσιτα του γένους Leishmania και ενδημεί σε πολλές περιοχές ανά τον κόσμο, και στη Μεσόγειο, ενώ o Παγκόσμιος Οργανισμός Υγείας την έχει καταχωρήσει στις παραμελημένες τροπικές ασθένειες. Η λεϊσμανίαση έχει ένα ευρύ φάσμα κλινικών εκδηλώσεων, από την αυτοϊάσιμη δερματική μορφή έως τη σπλαγχνική που μπορεί να αποβεί θανατηφόρος αν δε χορηγηθεί θεραπεία. Το παράσιτο που ευθύνεται για τη σπλαγχνική λεϊσμανίαση στις χώρες της Μεσογείου ανήκει στο είδος Leishmania (L.) infantum. Τα διαθέσιμα φάρμακα έναντι της νόσου χαρακτηρίζονται από μικρή αποτελεσματικότητα, υψηλή τοξικότητα και κόστος, ενώ τα τελευταία χρόνια έχει παρατηρηθεί ανάπτυξη ανθεκτικότητας των παρασίτων. Τα παραπάνω δεδομένα καθιστούν επιτακτική την ανάγκη ανάπτυξης ενός εμβολίου για την πρόληψη της λεϊσμανίασης. Τα πεπτιδικά ή πρωτεϊνικά εμβόλια έχουν το μειονέκτημα της χαμηλής ανοσογονικότητας και της ανάγκης χορήγησης πολλαπλών δόσεων. Γίνονται προσπάθειες να αντιμετωπιστεί το πρόβλημα αυτό με τη χρήση ανοσοενισχυτικών, τα οποία όμως σχετίζονται με φαινόμενα τοξικότητας. Προκειμένου να παρακαμφθούν τα συγκεκριμένα προβλήματα, έχει προταθεί η χρήση πολυμερών ως συστημάτων μεταφοράς αντιγόνων. Σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν διερεύνηση της ικανότητας πολυλειτουργικών νανοφορέων πολυ(D,L-γαλακτικού–co-γλυκολικού οξέος) (poly (D,L-lactic-co-glycolic acid, PLGA) να επάγουν προστατευτικές αποκρίσεις σε πρότυπο σπλαγχνικής λεϊσμανίασης. Σε νανοφορείς PLGA ενσωματώθηκε εκχύλισμα των προμαστιγωτών μορφών του παρασίτου L. infantum (sLiAg) και το ανοσοενισχυτικό MPLA. Οι νανοφορείς PLGA τροποποιήθηκαν επιφανειακά με ένα 8-πεπτίδιο (p8), η αλληλουχία του οποίου παρουσιάζει ομολογία με την περιοχή πρόσδεσης του TNFα στους υποδοχείς του. Οι νανοφορείς με την επιφανειακή τροποποίηση προσλαμβάνονταν πιο αποτελεσματικά από τα δενδριτικά κύτταρα, γεγονός που αποδίδεται σε ενδεχόμενη στόχευση των δενδριτικών κυττάρων από το p8, αλλά και στη μείωση της απόλυτης τιμής του επιφανειακού φορτίου των νανοφορέων. Η ενσωμάτωση του sLiAg ή και του MPLA, καθώς και η επιφανειακή τροποποίηση με το p8 προκάλεσαν την ωρίμανση και τη λειτουργική διαφοροποίηση των δενδριτικών κυττάρων, όπως αυτή εκφράστηκε μέσω της αύξησης των επιφανειακών δεικτών και της παραγωγής κυτταροκινών. Τα δενδριτικά κύτταρα είχαν την ικανότητα να παρουσιάζουν τα αντιγόνα του παρασίτου σε Τ λεμφοκύτταρα επάγοντας την ειδική ενεργοποίησή τους. Ο εμβολιασμός ποντικών BALB/c με τους νανοφορείς PLGA-sLiAg-MPLA και p8-PLGA-sLiAg είχε ως αποτέλεσμα τη σημαντική μείωση του παρασιτικού φορτίου και την ανάπτυξη διαμένουσας ανοσολογικής απόκρισης έναντι της μόλυνσης με L. infantum, μέσω της ενεργοποίησης βοηθητικών και κυτταροτοξικών Τ λεμφοκυττάρων και της καταστολής των υποπληθυσμών ΤΗ2 και Τ ρυθμιστικών λεμφοκυττάρων. Με βάση τα παραπάνω αποτελέσματα οι νανοσχηματισμοί αυτοί προτείνονται ως υποψήφια εμβόλια έναντι της σπλαγχνικής λεϊσμανίασης.