Επίδραση της ολευρωπαΐνης στην χρόνια καρδιακή ανεπάρκεια που προκαλεί η χορήγηση της αδριαμυκίνης: μελέτη του μηχανισμού δράσης

Abstract

Introduction: Oleuropein (OLEU) is a natural phenolic antioxidant, which is present in elevated concentration in olives, olive oil and olive tree leaves conferring protection to the heart. Adriamycin (DXR) is one of the most effective chemotherapeutic agents but with a dose-dependent induction of cardiomyopathy and heart failure. The aim of the present study was to evaluate the effect of OLEU in DXR-induced heart failure in vivo.Methods: Ninety rats were randomly divided into 6 groups and treated as follows: Control group with no treatment, OLEU-1 and OLEU-2 groups, treated with 1000 and 2000 mg/Kg of OLEU respectively, given intraperitoneally (i.p.), for 14 consecutive days, DXR group treated with i.p. injection of 18mg/kg of DXR, divided into 6 equal doses and given over a period of 2 weeks, DXR-OLEU-1 and DXR-OLEU-2 groups, rats treated with OLEU and DXR for 14 days as previously described. At the end of the injection protocols the rats were anesthetized and subjected transthoracic echocardiographic examination (Vivid-i, GE Healthcare with a 12MHz probe). Then the rats were sacrificed and the hearts were rapidly excised for histological evaluation and immunohistochemical evaluation, while the remainder was used for the estimation of malondialdehyde (MDA) and protein carbonyls (PCs) as markers of oxidative stress, nitrotyrosine (NT) as index «nitrosative» stress, interleukin-6 (IL-6) and Big endothelin-1 (Big ET-1), which are important indicators of cardiac remodeling, eNOS and iNOS with Western-Blot method as inflammatory markers, AMPK and Akt with Western-Blot method as indicators of energy metabolism and apoptosis, respectively, and finally held and the identification of biomarkers and metabolites by NMR spectroscopy, which is a reliable method for the study of changes of the metabolic profiles of the cardiac cell. Results: Eighty two rats completed the study. The mortality in the DXR group was 19% by end of the injection protocol. Normal morphology of the cardiac tissue was seen in the Control group and in groups OLEU-1 and OLEU-2. Myocardium exhibited morphological changes in DXR group only including edema, chronic inflammation and degeneration of myocardial cells such as vacuolization. In the DXR-OLEU-1 and DXR-OLEU-2 groups mild hypertrophy without edema, inflammation and myocardial degeneration was observed. DXR induced a small decrease in wall thickness, a decrease in left ventricular (LV) mass, a decrease in fractional shortening (an index of systolic function), an increase in end-systolic LV diameter, and a trend towards adverse cardiac remodeling. Combined DXR-OLEU and OLEU alone groups did not cause any change and the animals did not differ from the normal Control. Furthermore, OLEU reduced oxidative and «nitrosative» stress, induced by the administration of DXR, and reduced the increased levels of Big ET-1 and IL-6 that inducing the expression of iNOS and result in myocardial suppression. The results of Western blot analysis demonstrate that the administration of DXR causes deactivation of Akt and AMPK kinases and eNOS synthase in the myocardium in relation to the group of Control. The results demonstrate the adverse effect of DXR in anti-apoptotic mechanisms (Akt), in cardiac energy metabolism (AMPK) and homeostasis NO, molecule important for normal cardiac function (eNOS). Moreover, studying and the other groups observe that both the group of DXR-OLEU-1 and the group of DXR-OLEU-2, the negative effects of DXR mitigated not only a very significant amount, but reversed, indicating thereby the preventive effect of the OLEU in DXR-induced heart failure. In particular, OLEU increased phosphorylation of three proteins, thereby contributing to good cardiac function and preventing the occurrence and development of irreversible heart failure. Finally, by applying statistical analysis of NMR spectra with principal components analysis (PCA) we observed a clear separation between the metabolic profile of the group of Control and the group of DXR. The metabolic profile of the groups that received OLEU and DXR seems to be approaching the group of Control. Studying metabolites of the group of DXR observed inhibition of aerobic glycolysis and oxidation of fatty acids that appears to be related to the inhibition of the activation of AMPK. Instead, the combination of the DXR and OLEU shown to prevents the disturbance of energy metabolism by DXR.Conclusion: The present study shows for the first time that the administration of OLEU in rats under DXR anticancer therapy has cardioprotective effect against induced heart failure. The underlying mechanism is complex and beyond the antioxidant activity include reducing the effects of adriamycin in very important for apoptosis, energy production and cardiac function proteins Akt, AMPK and eNOS respectively.

Εισαγωγή: Η ολευρωπαΐνη (OLEU) αποτελεί το κύριο πολυφαινολικό συστατικό της ελιάς. Διαθέτει αξιοσημείωτες αντιοξειδωτικές ιδιότητες και έχει δειχθεί, μεταξύ άλλων, ότι εμφανίζει καρδιοπροστατευτική δράση. Η αδριαμυκίνη (DXR) αποτελεί έναν συχνά χρησιμοποιούμενο αντινεοπλασματικό παράγοντα, αλλά η χρήση της περιορίζεται από την εμφάνιση δοσοεξαρτώμενης καρδιομυοπάθειας και καρδιακής ανεπάρκειας. Ο σκοπός της παρούσας μελέτης είναι να αξιολογήσει την επίδραση της OLEU στην επαγόμενη από την DXR καρδιακή ανεπάρκεια in vivo. Μέθοθος: Ενενήντα επίμυες τυχαιοποιήθηκαν σε 6 ομάδες: Ομάδα ελέγχου, OLEU-1 και OLEU-2 στις οποίες χορηγήθηκαν 1000 και 2000 mg/kg OLEU αντίστοιχα ενδοπεριτοναϊκά (i.p.) για 14 συνεχόμενες ημέρες, ομάδα DXR στην οποία χορηγήθηκαν i.p. 18 mg/kg DXR σε έξι ισόποσες δόσεις μέσα σε διάστημα δύο εβδομάδων, ομάδες DXR-OLEU-1 και DXR-OLEU-2 στις οποίες χορηγήθηκαν OLEU και DXR για 14 ημέρες όπως αναφέρεται ανωτέρω. Μετά το τέλος του πρωτοκόλλου εγχύσεων οι επίμυες αναισθητοποιήθηκαν και πραγματοποιήθηκε ηχοκαρδιογραφική εξέταση (Vivid-i, GE Healthcare με 12MHz probe). Στη συνέχεια οι επίμυες θυσιάστηκαν και ο καρδιακός ιστός ταχύτατα αφαιρέθηκε, εκπλύθηκε αμέσως με φυσιολογικό ορό και διατηρήθηκε σε καταψύκτη στους -70οC. Ενα μέρος από τα δείγματα καρδιακού ιστού χρησιμοποιήθηκαν για ιστολογική και ανοσοϊστοχημική αξιολόγηση, ενώ το υπόλοιπο χρησιμοποιήθηκε για την εκτίμηση της μηλονικής διαλδεΰδης (MDA) και των πρωτεϊνικών καρβονυλίων (PCs) ως δείκτες οξειδωτικού στρες, της νιτροτυροσίνη (NT) ως δείκτη «nitrosative» στρες, της ιντερλευκίνης-6 (IL-6) and Big ενδοθηλίνης-1 (Big ET-1) που αποτελούν σημαντικούς δείκτες της καρδιακής αναδιαμόρφωσης, της iNOS και eNOS με την μέθοδο Western-Blot ως δείκτες φλεγμονής, της AMPK και Akt με την μέθοδο Western-Blot ως δείκτες του ενεργειακού μεταβολισμού και απόπτωσης αντίστοιχα, ενώ τέλος πραγματοποιήθηκε και ο προσδιορισμός των βιοδεικτών και μεταβολιτών μέσω φασματοσκοπία NMR η οποία αποτελεί αξιόπιστη μέθοδο για την μελέτη αλλαγών του μεταβολικού προφίλ του μυοκαρδίου. Αποτελέσματα: Ογδόντα δύο πειραματόζωα επιβίωσαν μετά το τέλος του πειραματικού μέρους της μελέτης. Η θνητότητα στην ομάδα της DXR ήταν 19% μετά το τέλος των χορηγήσεων. Η μορφολογία των καρδιακών ιστών ήταν φυσιολογική στην ομάδα των control καθώς και στις ομάδες OLEU-1 και OLEU-2. Αντίθετα στην ομάδα της DXR παρατηρήθηκαν αλλοιώσεις που περιελάμβαναν οίδημα, χρόνια φλεγμονή καθώς και εκφύλιση των μυοκαρδιακών ιστών. Τέλος, στις ομάδες DXR-OLEU-1 και DXR-OLEU-2 παρατηρήθηκε μια μικρή υπερτροφία των καρδιακών ιστών χωρίς όμως να συνυπάρχουν στοιχεία οιδήματος, χρόνιας φλεγμονής και εκφύλισης. Στην ομάδα της DXR οι υπέρηχοι κατέδειξαν μείωση της μάζας της αριστερής κοιλίας, μείωση του κλάσματος εξώθησης της αριστερής κοιλίας, αύξηση της τελο-συστολικής διαμέτρου της αριστερής κοιλίας καθώς και τάση για καρδιακή αναδιαμόρφωση. Αντίθετα, στις ομάδες OLEU-1 και OLEU-2 καθώς και στις ομάδες DXR-OLEU-1 και DXR-OLEU-2 οι υπέρηχοι δεν παρουσίαζαν καμία διαφοροποίηση σε σχέση με την ομάδα των Control. Επιπλέον η OLEU μείωσε το οξειδωτικό και «nitrosative» στρες, που επάγεται από την χορήγηση της DXR, ενώ μείωσε και τα αυξημένα επίπεδα της Big ET-1 και IL-6 που επάγουν την έκφραση της iNOS και έχουν σαν αποτέλεσμα την καταστολή του μυοκαρδίου. Από τα αποτελέσματα της Western blot ανάλυσης, διαπιστώνουμε αρχικά ότι η DXR προκαλεί απενεργοποίηση των Akt και AMPK κινασών και της eNOS συνθάσης στο μυοκάρδιο σε σχέση με την ομάδα των Control. Τα αποτελέσματα αποδεικνύουν την αρνητική επίδραση της DXR στους αντί-αποπτωτικούς μηχανισμούς (Akt), στον καρδιακό ενεργειακό μεταβολισμό (AMPK) και την ομοιόσταση του NO, μορίου σημαντικού για την φυσιολογική καρδιακή λειτουργία (eNOS). Επιπλέον, μελετώντας και τις υπόλοιπες ομάδες παρατηρούμε ότι τόσο στην ομάδα DXR-OLEU-1 όσο και στην DXR-OLEU-2, οι αρνητικές επιδράσεις της DXR όχι μόνο μετριάσθηκαν σε πολύ σημαντικό ποσό, αλλά και αντιστράφηκαν, υποδεικνύοντας με αυτόν τον τρόπο την προληπτική δράση της OLEU στην επαγόμενη από την DXR καρδιακή ανεπάρκεια. Πιο συγκεκριμένα, η OLEU αύξησε τα ποσοστά φωσφορυλίωσης των τριών υπό μελέτη πρωτεϊνών, συντελώντας έτσι στην καλή καρδιακή λειτουργία και εμποδίζοντας την εκδήλωση και ανάπτυξη μη αναστρέψιμης καρδιακής ανεπάρκειας. Τέλος, εφαρμόζοντας στατιστική επεξεργασία των φασμάτων NMR με ανάλυση κυρίων συνιστωσών (PCA) παρατηρήσαμε σαφή διαχωρισμό στο μεταβολικό προφίλ μεταξύ της ομάδας των Control και της ομάδας της DXR. Το μεταβολικό προφίλ των ομάδων που έλαβαν DXR και OLEU φαίνεται να πλησιάζει αυτό της ομάδας των Control. Μελετώντας τους μεταβολίτες στην ομάδα της DXR παρατηρήσαμε αναστολή της οδού της αερόβιας γλυκόλυσης και της οξείδωσης των λιπαρών οξέων που φαίνεται να σχετίζεται με την αναστολή της ενεργοποίησης της AMPK. Αντίθετα ο συνδυασμός της DXR με την OLEU φαίνεται προλαμβάνει την διαταραχή του ενεργειακού μεταβολισμού από την DXR. Συμπέρασμα: Η παρούσα εργασία δείχνει για πρώτη φορά ότι η χορήγηση της OLEU σε επίμυες υπό DXR αντικαρκινική θεραπεία έχει καρδιοπροστατευτική δράση έναντι της επαγόμενης καρδιακής ανεπάρκειας. Ο υποκείμενος μηχανισμός είναι σύνθετος και εκτός της αντιοξειδωτικής δράσης περιλαμβάνει και τον περιορισμό των οδυνηρών επιπτώσεων της αδριαμυκίνης στις πολύ σημαντικές για την απόπτωση, παραγωγή ενέργειας και καρδιακή λειτουργία πρωτεΐνες Akt, AMPK και eNOS αντίστοιχα.