Παραγωγή β-γλυκανών από ζυμομύκητες υποπροϊόντων οινοποιίας

Abstract

In this thesis, the first isolation and production of yeast β-glucan from a completelynew and unexplored source, yeast cell walls from winery spent yeast biomass (winerysludge) was achieved with a sustainable and ‘green’ method which: 1) is suitable forβ-glucan industrial scale production from winery by-products, 2) is able to treat thehuge quantities of wine sludge produced every year in winery fermentation tankswithout producing new wastes but unlike, the generated wastes can be valorized orreutilized for the recovery of more products, 3) is able to produce an added valueproduct which is intended for its incorporation in functional foods and medicines and4) has a degree of sustainability with an ecological direction towards the protection ofthe environment through the valorization of an industrial waste.In the first part of this thesis, a technical evaluation of various isolation andpurification methods from yeast was done. The methods were evaluated as to therequired steps and their optimal conditions, the time needed, the required technicalequipment, the drying method of the final product, its solubility or not in water, itsyield and purity, the yeast growth conditions as also the parallel production of otherproducts during β-glucan production process. The aim of the evaluation was theenlightenment on which method suits for lab scale and which one for industrial scaleβ-glucan production, as the offered methods for its isolation provide confusedtechnical information. The evaluation revealed that Method 2 can be used for thepurpose of this study. In the next part, three different production protocols were compiled based on theinformation received from the evaluation study of the previous part, which wereexperimentally tested in lab. Protocol 3, which was based on Method 2, gave the bestresults in β-glucan purity and yield during its production (purity 64.56 ± 1.25 % of βglucanin final yeast powder and yield in β-glucan 10.01 ± 0.42 %.Next, protocol 3 β-glucan production steps were optimized: 1. Yeast cell autolysis and2. β-Glucan isolation with the use of hot NaOH. The optimization was done becausein the international bibliography, this method has not been optimized for its steps.With optimal extraction conditions, the produced β-glucan was 70.8 ± 1.44 % purewith 12.56 ± 0.24 % yield. In the next part, this method was used for β-glucan isolation from spent yeast biomassin wine sludge and more precisely from red and white lees. With optimal extractionconditions, the produced β-glucan was 32.95 ± 0.30 %, 43.37 ± 0.65 % pure andyielded 2.45 ± 0.03 %, 11.21 ± 0.17 % for red and white lees respectively with theproviso that for the max β-glucan purity, its isolation must take place at the end ofalcoholic fermentation.In the last experimental part, a study of the production of β-glucan in the cell wall ofwine yeast S. cerevisiae during the alcoholic fermentation under the influence ofdifferent glucose concentrations and hyperosmotic stress with the use of NaCl, ofyeast cells salt preconditioning or not before media inoculation, took place. Theresults revealed that β-glucan increases during yeast growth exponential phase and atthe end of this reaches to a peak and then starts to decrease during yeast cell death andlysis phase. The results confirmed the results of the previous section about theoptimum time for wine lees harvesting and treating for β-glucan production.

Στην παρούσα διατριβή έγινε για πρώτη φορά απομόνωση και παραγωγή β-γλυκανών από μια νέα και ανεξερεύνητη πηγή, τα κυτταρικά τοιχώματα των ζυμομυκήτων των υποπροϊόντων οινοποιίας (οινολάσπες), με μια ‘πράσινη’ τεχνολογία η οποία: 1) είναι κατάλληλη για βιομηχανική παραγωγή β-γλυκάνης από τα υποπροϊόντα οινοποιίας,2) μπορεί να διαχειριστεί τις τεράστιες ποσότητες των παραγόμενων υποπροϊόντων στις δεξαμενές ζύμωσης των οινοποιητικών μονάδων χωρίς παράλληλα να δημιουργεί νέους ρύπους αλλά αντίθετα, οι παραγόμενοι ρύποι να μπορούν να επαναχρησιμοποιηθούν ή να χρησιμοποιηθούν για την ανάκτηση επιπλέον προϊόντων, 3) παράγει ένα προϊόν προστιθέμενης αξίας το οποίο προορίζεται για ενσωμάτωση σε λειτουργικά τρόφιμα και φάρμακα και 4) είναι σε μεγάλο βαθμό αειφορική με μια οικολογική κατεύθυνση προς την προστασία του περιβάλλοντος μέσω της αξιοποίησης ενός βιομηχανικού αποβλήτου.Στο πρώτο μέρος της διατριβής αυτής έγινε μια τεχνική αξιολόγηση διαφόρωνμεθοδολογιών απομόνωσης και παραλαβής β-γλυκανών από ζυμομύκητες. Οι μέθοδοι αξιολογήθηκαν ως προς τα απαιτούμενα βήματα παραγωγής και τις βέλτιστες συνθήκες τους, τον απαιτούμενο χρόνο, τον απαιτούμενο υλικοτεχνικό εξοπλισμό, τον τρόπο ξήρανσης του τελικού προϊόντος, τη διαλυτότητά του ή μη στο νερό, την απόδοση και καθαρότητα της παραγόμενης β-γλυκάνης, τον τρόπο προσδιορισμού της, τις συνθήκες ανάπτυξης των ζυμών καθώς και την παραγωγή άλλων προϊόντων κατά τη διαδικασία παραγωγής της β-γλυκάνης. Ο σκοπός της αξιολόγησης ήταν να διαφωτιστεί το τοπίο σχετικά με το ποια μέθοδος ταιριάζει για εργαστηριακή και ποια για βιομηχανική παραγωγή β-γλυκάνης, μιας και για την απομόνωση της υπάρχει πληθώρα τεχνολογιών όμως με συγκεχυμένες τεχνικές πληροφορίες. Η αξιολόγηση έδειξε πως η Μέθοδος 2 θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί για το σκοπό της διατριβής αυτής.Στο επόμενο μέρος, καταρτίστηκαν τρία πρωτοκόλλα παραγωγής βασισμένα στις αξιολογούμενες μεθόδους, τα οποία δοκιμάστηκαν στο εργαστήριο. Το πρωτόκολλο 3, το οποίο βασίστηκε στην αξιολογούμενη Μέθοδο 2, έδωσε τα καλύτερα αποτελέσματα σε καθαρότητα και απόδοση παραγόμενου προϊόντος (καθαρότητα 64.56 ± 1.25 % σε β-γλυκάνη στην τελική ξηρή σκόνη από κυτταρικό υλικό ζυμομυκήτων και απόδοση σε β-γλυκάνη 10.01 ± 0.42 %. Στη συνέχεια, το πρωτόκολλο 3 βελτιστοποιήθηκε ως προς τα βήματα παραγωγής της β-γλυκάνης: 1. Την αυτόλυση των κυττάρων και 2. Την απομόνωση της β-γλυκάνης με τη χρήση ζεστού NaOH. Η βελτιστοποίηση έγινε γιατί από τη διεθνή βιβλιογραφία, η μέθοδος αυτή δεν έχει βελτιστοποιηθεί σε όλα της τα βήματα. Με τις βέλτιστες συνθήκες απομόνωσης, η παραγόμενη β-γλυκάνη είχε καθαρότητα 70.8 ±1.44 % και απόδοση 12.56 ± 0.24 %.Στην επόμενη ενότητα, η μέθοδος αυτή χρησιμοποιήθηκε για την απομόνωση β γλυκάνης από ζυμομύκητες υποπροϊόντων οινοποιίας και πιο συγκεκριμένα από ερυθρές και λευκές οινολάσπες. Με τις βέλτιστες συνθήκες απομόνωσης, η παραγόμενη β-γλυκάνη είχε μέγιστη καθαρότητα 32.95 ± 0.30 %, 43.37 ± 0.65 % και απόδοση 2.45 ± 0.03 και 11.21 ± 0.17 % για τις ερυθρές και λευκές οινολάσπες αντίστοιχα ενώ για την παραλαβή της μέγιστης καθαρότητας σε β-γλυκάνη, η απομόνωσή της θα πρέπει να γίνεται αμέσως μετά το τέλος της αλκοολικής ζύμωσης.Στην τελευταία ενότητα, έγινε μελέτη σε συνθετικό μέσο ανάπτυξης, της παραγωγής της β-γλυκάνης στο κυτταρικό τοίχωμα του ζυμομύκητα οινοποιίας S. cerevisiaeκατά τη διάρκεια της αλκοολικής ζύμωσης, υπό την επίδραση διαφορετικών συγκεντρώσεων γλυκόζης και του προεγκλιματισμού των κυττάρων πριν το εμβολιασμό σε υπεροσμωτικό ή όχι περιβάλλον με τη χρήση NaCl. Τα αποτελέσματα έδειξαν πως η β-γλυκάνη αυξάνει κατά την εκθετική φάση ανάπτυξης του ζυμομύκητα και στο τέλος της εκθετικής φάσης φθάνει σε ένα μέγιστο ενώ αρχίζει να μειώνεται κατά τη φάση θανάτου και λύσης του κυττάρου. Η ενότητα αυτή επιβεβαίωσε τα αποτελέσματα της προηγούμενης ενότητας σχετικά με το βέλτιστο χρόνο συγκομιδής της οινολάσπης και της επεξεργασίας της για την παραγωγή βγλυκάνης.