Ο έλεγχος του φάσματος των αντιπυρηνικών αντισωμάτων στη διαγνωστική προσέγγιση αυτοάνοσων νοσημάτων του συνδετικού ιστού: η καθιέρωση αλγορίθμου αναζήτησης των αντισωμάτων αυτών και η αξία του σε επιστημονικό και οικονομικό επίπεδο

Abstract

Serological testing for the detection of autoantibodies is without doubt vital ineveryday clinical practice, regarding initial diagnosis of connective tissue disorders,their systematic monitoring as well as evaluation of treatment used.A clinical laboratory oriented towards autoimmune disorders evaluation, performs,among others, anti-nuclear (ANA) and anti-extractable nuclear antigen (anti-ENA), aswell as anti-double stranded DNA (anti-dsDNA) antibodies detection.One should consider the impact of unwarranted testing not only due to cost but alsoon timely result delivery, which can lead to prolonged undue hospitalizations andeven delays in necessitated prompt treatment so it is evident that these tests shouldbe ordered following careful consideration. To this end the presence of substantialindications of an underlying immunological disorder from the patient’s medicalhistory and current clinical presentation is essential, as well as the closecollaboration of the clinical and laboratory staff not only in interpreting results butalso in planning additional patient-tailored testing.AIMThe aim of this large retrospective study was to evaluate the presence of antinuclearantibodies as well as their specificity in autoimmune disorders diagnosis,differential diagnosis and disease prognosis. Finally, a diagnostic algorithm onsystemic autoantibodies detection and identification is proposed in order lowlaboratory cost with maximum diagnostic accuracy and value to be obtained.Patients and methodsThe study included a total of 23.822 consecutive blood samples collected over athree year period, from both hospitalized and outpatients of the “Evangelismos”General Hospital, referred to the Dept of Immunology-Histocompatibility for ANAand other specific autoantibodies testing. The majority of patients tested werefemales 70,2% (16.727) while the remaining 29,8% (7.095) males. Outpatientsamples accounted for 59,7% of the total samples assessed. During the study period different clinical Depts requested autoimmune antibody testing for hospitalizedpatients with the Internal Medicine and Neurology Depts exhibiting the largestpercentages of referrals (13,5% and 8,3% respectively).ANA were detected by indirect immunofluorescence using Hep-2 cells. Samplesreferred for anti-dsDNA antibodies were initially screened using indirectimmunofluorescence with Crithidia luciliae as a substrate and subsequently positivesamples were quantified with a radioimmunology assay (RIA). Enzyme-linkedimmunosorbent assay (ELISA) was used to screen for anti-ENA antibodies and toidentify anti-rib P, anti-HIST and anti-ENA (anti-Sm, anti-RNP, anti-SSA, anti-SSB andanti-Jo-1) antibodies. Finally, anti- Scl-70 antibodies were detected usingOuchterlony double immunodiffusion.Statistical analysisFor the results statistical analysis the program SPSS 17.0 was used. Absolute (Ν) andrelative values (%) were used for the definition of qualitative variables, whereas thePearson’s χ2 or the Fisher's exact test was applied for the correlation, where it wasnecessary. The significance level was set at 0.05.ResultsTesting for ANA was requested and performed on all samples (23.822), anti-dsDNAwere sought on a total of 18.111 samples, while anti-ENA on 13.018 samples. For themajority of samples (46,1%) the initial referral included all three of theaforementioned antibodies, while only 15,4% requested only the detection of ANA,which is however the basic screening test for immunological disorders.1. Determination of ANA fluorescence titre and pattern showed the followingresults: a. About half of the samples sent to our laboratory (11.944 - 50,1%) werenegative for ANA, while 49,9% were positive. In positive samples ANA titre ofmarginally positive values (1:160) accounted for the largest percentage (18,8%),while significantly positive titres of (>1/640) were next in frequency (13,8%). b. Speckled type fluorescence was the most commonly observed (68,40%),followed by the homogeneous type (22,4%). Pleomorphic patterns due toproliferating cell nuclear antibodies (PCNA) and Golgi apparatus were rarelyobtained, at low incidence (0,05% and 0,01% respectively).c. Highly positive samples (titres > 1:640) were more commonly found in femalesthan in males (17,2% and 5,9% respectively).2. In regards to ANA specificity, positive anti-dsDNA were noticed in 5,0% of thesamples tested. The highest percentages were found in those samples sent frompatients of the Rheumatology (19,3%) and Nephrology (15,0%) Dept and from theoutpatient pool (5,8%). Anti-dsDNA retrieval rates from other Hospital Depts weresignificantly lower (0,6%-2,5%).3. Positive anti-ENA screening tests were noticed in 11,1% of the samples tested.Outpatient samples statistically accounted for the largest percentage (11,6%).However in absolute numbers the majority of positive anti-ENA samples originatedfrom patients of the Rheumatology Dept followed by those from the InternalMedicine and Nephrology Depts.4. Statistically significant difference (p <0.001) comes out from the comparison ofANA specificity in ANA positive and ANA negative sera. Thus, in 3,4% of ANA negativescreening sera there were observed ANA specificities, like anti-Ro antibodies. Anexception is the presence of anti-rib P and anti-Jo1 in 14,8% (p=0.720) and 1,2%(p=0.702) respectively, because there is a cytoplasmic fluorescence image in Hep-2,hence negative ΑΝΑ. It is worth noticing that a statistically significant difference (p<0.001) is also recorded from the comparison of the specificity of ANA by increasingthe titre of ANA.5. Evaluation of ANA specificity and pattern of fluorescence showed that anti-dsDNAantibodies are usually associated with homogeneous patterns (23,3%), while antiENAwith speckled ones (20,1%).6. The analysis and evaluation of the repetitive ANA tests ordered (7864 samples),allows for the following observations: α. 58,2% of re-ordered testing is noticed in the out-patient pool, whilerespective percentage for Rheumatology Dept patients remain low (3,5%).b. The number of re-ordered tests per patient ranged from 2 to 15 within thethree year study period. It should also be noticed that a high percentage ofre-ordered testing (39,7%) was seen in cases of previously negative ANAresults.c. Evaluation of titre fluctuation of ANA tests revealed very low rates (1,6%,4,1% and 9%) of four, three and two fold dilution variations respectively.d. ANA re-testing was significantly higher in the first year of the study(73,2%), especially in the first trimester of the year in question (33,3%), whilethis percentage declined to 19,7% in the second year and to 7,1% in the thirdone.ConclusionsThe increasing frequency at which autoimmune disorders are observed worldwide,in association to technological evolution used over the recent years in autoantibodydetection, has led to an increase in the number of tests ordered and performed. Inthe current health care setting, which demands also reductions in costs, it is crucialto apply for a more rational use of the available autoantibody testing panel, whichtakes into account the optimal cost-benefit parameter and does not, in any way,compromise the healthcare quality offered. Taking into account the demands ofevery day clinical practice as well as several aspects of the laboratory workflow,mainly the methodology applied, we propose diagnostic guidelines which target notonly on avoiding needless testing but also in achieving the most comprehensiveapproach in evaluating autoimmune disorders.

Η αξία της διενέργειας ορολογικών εξετάσεων στα πλαίσια αναζήτησης των αυτοαντισωμάτων, είναι αναμφίβολα σημαντική στην καθημερινή κλινική πράξη, σε επίπεδο αρχικής διάγνωσης κυρίως των νοσημάτων του συνδετικού ιστού, αλλά και συστηματικής παρακολούθησης και ανταπόκρισης αυτών στα διάφορα θεραπευτικά σχήματα.Ο συνήθης αιτούμενος εργαστηριακός έλεγχος, στην προσπάθεια διαγνωστικής προσέγγισης κυρίως ρευματικών νοσημάτων, αφορά στην αναζήτηση και στον προσδιορισμό των αντιπυρηνικών αντισωμάτων (ΑΝΑ), των αντισωμάτων έναντι εκχυλιζόμενων αντιγόνων του πυρήνα (anti-ΕΝΑ – extractable nuclear antigens)καθώς και των αντισωμάτων έναντι διπλής έλικας DNA (anti-dsDNA).Δεδομένου του κόστους διενέργειας του προσδιορισμού των εργαστηριακών αυτών εξετάσεων, ο οποίος πρέπει να συνυπολογίζεται με το κόστος νοσηλείας αλλά και την καθυστέρηση έναρξης κατάλληλης θεραπείας, οι εν λόγω εξετάσεις δεν θα πρέπει να παραγγέλνονται αλόγιστα και άσκοπα. Απαιτείται λοιπόν αφενός μεν να υπάρχει ένδειξη, όπως αυτή προκύπτει από την κλινική εικόνα και το ιστορικό του ασθενούς, αφετέρου δε επιβάλλεται η στενή συνεργασία κλινικών και εργαστηριακών ιατρών, τόσο για την ορθολογική παραγγελία αλλά και τη σωστή αξιολόγηση των εργαστηριακών ευρημάτων όσο και για τον τυχόν περαιτέρω διευκρινιστικό εργαστηριακό έλεγχο.Η αξία της διενέργειας ορολογικών εξετάσεων στα πλαίσια αναζήτησης των αυτοαντισωμάτων, είναι αναμφίβολα σημαντική στην καθημερινή κλινική πράξη, σε επίπεδο αρχικής διάγνωσης κυρίως των νοσημάτων του συνδετικού ιστού, αλλά και συστηματικής παρακολούθησης και ανταπόκρισης αυτών στα διάφορα θεραπευτικά σχήματα. Ο συνήθης αιτούμενος εργαστηριακός έλεγχος, στην προσπάθεια διαγνωστικής προσέγγισης κυρίως ρευματικών νοσημάτων, αφορά στην αναζήτηση και στον προσδιορισμό των αντιπυρηνικών αντισωμάτων (ΑΝΑ), των αντισωμάτων έναντι εκχυλιζόμενων αντιγόνων του πυρήνα (anti-ΕΝΑ – extractable nuclear antigens)καθώς και των αντισωμάτων έναντι διπλής έλικας DNA (anti-dsDNA). Δεδομένου του κόστους διενέργειας του προσδιορισμού των εργαστηριακών αυτών εξετάσεων, ο οποίος πρέπει να συνυπολογίζεται με το κόστος νοσηλείας αλλά και την καθυστέρηση έναρξης κατάλληλης θεραπείας, οι εν λόγω εξετάσεις δεν θα πρέπει να παραγγέλνονται αλόγιστα και άσκοπα. Απαιτείται λοιπόν αφενός μεν να υπάρχει ένδειξη, όπως αυτή προκύπτει από την κλινική εικόνα και το ιστορικό του ασθενούς, αφετέρου δε επιβάλλεται η στενή συνεργασία κλινικών και εργαστηριακών ιατρών, τόσο για την ορθολογική παραγγελία αλλά και τη σωστή αξιολόγηση των εργαστηριακών ευρημάτων όσο και για τον τυχόν περαιτέρω διευκρινιστικό εργαστηριακό έλεγχο.Η αξία της διενέργειας ορολογικών εξετάσεων στα πλαίσια αναζήτησης των αυτοαντισωμάτων, είναι αναμφίβολα σημαντική στην καθημερινή κλινική πράξη, σε επίπεδο αρχικής διάγνωσης κυρίως των νοσημάτων του συνδετικού ιστού, αλλά και συστηματικής παρακολούθησης και ανταπόκρισης αυτών στα διάφορα θεραπευτικά σχήματα.Ο συνήθης αιτούμενος εργαστηριακός έλεγχος, στην προσπάθεια διαγνωστικής προσέγγισης κυρίως ρευματικών νοσημάτων, αφορά στην αναζήτηση και στον προσδιορισμό των αντιπυρηνικών αντισωμάτων (ΑΝΑ), των αντισωμάτων έναντι εκχυλιζόμενων αντιγόνων του πυρήνα (anti-ΕΝΑ – extractable nuclear antigens)καθώς και των αντισωμάτων έναντι διπλής έλικας DNA (anti-dsDNA).Δεδομένου του κόστους διενέργειας του προσδιορισμού των εργαστηριακών αυτών εξετάσεων, ο οποίος πρέπει να συνυπολογίζεται με το κόστος νοσηλείας αλλά και την καθυστέρηση έναρξης κατάλληλης θεραπείας, οι εν λόγω εξετάσεις δεν θα πρέπει να παραγγέλνονται αλόγιστα και άσκοπα. Απαιτείται λοιπόν αφενός μεν να υπάρχει ένδειξη, όπως αυτή προκύπτει από την κλινική εικόνα και το ιστορικό του ασθενούς, αφετέρου δε επιβάλλεται η στενή συνεργασία κλινικών και εργαστηριακών ιατρών, τόσο για την ορθολογική παραγγελία αλλά και τη σωστή αξιολόγηση των εργαστηριακών ευρημάτων όσο και για τον τυχόν περαιτέρω διευκρινιστικό εργαστηριακό έλεγχο. Σκοπός. Σκοπός λοιπόν της παρούσας μελέτης είναι η καταγραφή και η μελέτη των αυτοαντισωμάτων που παραγγέλθηκαν τόσο από τις κλινικές όσο από το εξωτερικό ιατρείο του Π.Γ.Ν.Α «ο Ευαγγελισμός» για το χρονικό διάστημα μιας τριετίας.Ειδικότερα, η εκτίμηση του τρόπου παραγγελίας αλλά και της μεθοδολογίας του προσδιορισμού των αντιπυρηνικών αντισωμάτων καθώς και της ειδικότητας αυτών,αλλά και η αξιολόγηση του αποτελέσματος, με σκοπό την ανάδειξη της συμβολής του ελέγχου τους στη διαγνωστική και διαφοροδιαγνωστική προσέγγιση των αυτοάνοσων νοσημάτων, αποτελεί κύριο στόχο της μελέτης. Επίσης γίνεται προσπάθεια κατάρτισης αλγορίθμου αναζήτησης των ανοσολογικών αυτών παραμέτρων, συνυπολογίζοντας τη σχέση κόστους-οφέλους, έτσι ώστε να εξασφαλίζεται το χαμηλότερο κόστος με την υψηλότερη διαγνωστική αξία.. Ασθενείς και Μέθοδοι Η μελέτη συμπεριλαμβάνει 23.822 διαδοχικά δείγματα ορού εξωτερικών (14.224/59,7%) και εσωτερικών (9.598/40,3%) ασθενών που προσκομίστηκαν κατά τη χρονική περίοδο μιας τριετίας στο Τμήμα Ανοσολογίας-Ιστοσυμβατότητας του Γ.Ν.Α«ο Ευαγγελισμός», με την εντολή για αναζήτηση ΑΝΑ και άλλης ειδικότητας συστηματικών αυτοαντισωμάτων. Στην πλειοψηφία τα δείγματα προέρχονται από γυναίκες 16.727 (70,2%), ενώ τα 7.095 (29,8%) ήταν άνδρες.Σε όλα τα δείγματα αναζητήθηκαν τα αντιπυρηνικά αντισώματα (ΑΝΑ). Ο προσδιορισμός των έναντι διπλής έλικας DNA αντισώματα (αντι-dsDNA) έγινε σε 18.111 δείγματα, ενώ των αντισωμάτων έναντι εκχυλιζόμενων αντιγόνων του πυρήνα (αντι-ΕΝΑ) σε 13.018 δείγματα. Στην πλειονότητα των δειγμάτων (46,1%)παραγγέλθηκε εξαρχής ο συνδυασμός ΑΝΑ, αντι-dsDNA και αντι-ΕΝA αντισωμάτων,ενώ η αναζήτηση μόνο ΑΝΑ, που αποτελεί και το αρχικό screening test, έγινε σε μικρότερο ποσοστό (15,4%).Η μέθοδος του έμμεσου ανοσοφθορισμού (IIF), σε υπόστρωμα ανθρωπίνων επιθηλιακών κυττάρων καρκίνου ρινοφάρυγγος (Hep-2), χρησιμοποιήθηκε για την ανίχνευση των ΑΝΑ. Η ίδια μέθοδος, χρησιμοποιώντας ως υπόστρωμα το μαστιγοφόρο πρωτόζωο Crithidia luciliae, εφαρμόστηκε στην αναζήτηση των αντιdsDNA,στα δε θετικά με IIF δείγματα ακολούθησε ποσοτικός προσδιορισμός τους με ραδιοανοσολογική μέθοδο (RIA). Ο ποιοτικός προσδιορισμός των αντι-ΕΝΑ αντισωμάτων (screening test), η αναζήτηση της ειδικότητάς τους (αντι-Sm, αντιRNP,αντι-SSA, αντι-SSB και αντι-Jo-1), καθώς και ο προσδιορισμός των έναντι ριβοσωμιακής Ρ πρωτεΐνης (rib P) και των έναντι ιστονικών πρωτεϊνών (αντι-Hist)αντισωμάτων, έγιναν με ανοσοενζυμική μέθοδο ΕLISA. Τέλος, τα αντισώματα κατά του σκληροδέρματος (Scl-70) αναζητήθηκαν με την κλασσική τεχνική της διπλής ανοσοδιάχυσης κατά Ouchterlony. Στατιστική ανάλυση. Οι απόλυτες (Ν) και οι σχετικές (%) συχνότητες χρησιμοποιήθηκαν για την περιγραφή των ποιοτικών μεταβλητών των αυτοαντισωμάτων. Για τη σύγκριση αναλογιών χρησιμοποιήθηκε το Pearson’s χ2 test ή το Fisher's exact test όπου ήταν απαραίτητο. Τα επίπεδα σημαντικότητας είναι αμφίπλευρα και η στατιστική σημαντικότητα τέθηκε στο 0,05. Για την ανάλυση χρησιμοποιήθηκε το στατιστικό πρόγραμμα SPSS 17.0. Αποτελέσματα. 1. Ο προσδιορισμός του τίτλου αλλά και του τύπου φθορισμού των ΑΝΑ έδωσε τα κάτωθι αποτελέσματα:α. Από ο σύνολο των δειγμάτων, τα 11.944 (50,1%) είχαν αρνητικά ΑΝΑ, ενώ από τα θετικά ΑΝΑ δείγματα (49,9%), το μεγαλύτερο ποσοστό (18,8%) ήταν σε τίτλο 1:160 δηλαδή σε σχετικά χαμηλά επίπεδα (οριακά θετικά) και ακολουθεί σε συχνότητα (13,8%) ο τίτλος >1:640.β. Ο πιο συχνός τύπος φθορισμού ήταν ο στικτός (68,40%) και ακολουθεί ο διάχυτος (22,47%), ενώ η παρουσία φθορισμού PCNA (proliferating cell nuclearantibodies) και συσκευής Golgi εμφανίζονται σπανιότατα (0,05 και 0,01 αντίστοιχα).γ. Θετικά δείγματα σε υψηλούς τίτλους (>1:640) ανευρίσκονται σε μεγαλύτερα ποσοστά στις γυναίκες απ’ ότι στους άνδρες (17,2% έναντι 5,9%)2. Αναφορικά με την αναζήτηση της ειδικότητας των ΑΝΑ, θετικά αντι-dsDNAαντισώματα καταγράφηκαν στο 5,0% του συνόλου των δειγμάτων, με υψηλότερα ποσοστά στους ασθενείς της Ρευματολογικής (19,3%) και της Νεφρολογικής Kλινικής (15,0%) και του Eξωτερικού Iατρείου (5,8%). Σε όλες τις άλλες κλινικές θετικά αντι-dsDNA καταγράφηκαν σε πολύ χαμηλότερα επίπεδα (0,6%-2,5%).3. Θετικά αντι-ΕΝΑ (screening test) αντισώματα προσδιορίστηκαν στο 11,1% του συνόλου των δειγμάτων, με υψηλότερο ποσοστό σε δείγματα του Εξωτερικού Ιατρείου (11,6%). Σε απόλυτους όμως αριθμούς τα περισσότερα αντι-ΕΝΑ θετικά δείγματα καταγράφονται στην Ρευματολογική και ακολουθεί η Παθολογική και η Νεφρολογική Kλινική. 4. Στατιστικά σημαντική διαφορά (p<0,001) προκύπτει από την σύγκριση της ειδικότητας των ΑΝΑ με την θετικότητα τους, καθώς η παρουσία ειδικότητας κυμαίνεται σε ποσοστό από 0% έως 3,4% για τις περισσότερες παραμέτρους, όταντα ΑΝΑ είναι αρνητικά. Εξαίρεση αποτελεί η παρουσία των αντι-rib P και αντι-Jo1 σε ποσοστό 14,8% (p=0,720) και 1,2% (p=0,702) αντίστοιχα, διότι δίνουνκυτταροπλασματική εικόνα φθορισμού στα Hep-2, άρα αρνητικά ΑΝΑ. Αξίζει όμως να σημειωθεί ότι στατιστικά σημαντική διαφορά (p<0,001) καταγράφεται επίσης από την σύγκριση της ειδικότητας των ΑΝΑ με την αύξηση του τίτλου των ΑΝΑ. 5. Από την εκτίμηση του συνδυασμού της ειδικότητας των ΑΝΑ με τον τύπο φθορισμού προκύπτει ότι τα αντι-dsDNA αντισώματα συνοδεύονται συνήθως με διάχυτο τύπο (23,3%), ενώ τα αντι-ΕΝΑ με στικτό τύπο (20,1%) φθορισμού.6. Από την καταγραφή και αξιολόγηση των επαναληπτικών μετρήσεων των ΑΝΑ(7864 δείγματα) προκύπτουν τα ακόλουθα αποτελέσματα:α. Το 58,2% των επαναλήψεων αφορούν σε εξωτερικούς ασθενείς, ενώ σχετικά χαμηλό ποσοστό (3,5%) αφορά σε ασθενείς της Ρευματολογική ςΚλινικής. β. Ο αριθμός των επαναληπτικών μετρήσεων ανά ασθενή κυμαίνεται από 2 έως 15 στην τριετία που μελετήθηκε. Αξίζει να σημειωθεί ότι υψηλό ποσοστό (39,7%) επαναλήψεων παρατηρήθηκε και επί αρνητικών ΑΝΑ σε προηγούμενη μέτρηση.γ. Από την ανάλυση των μεταβολών του τίτλου των ΑΝΑ σε επαναλαμβανόμενες μετρήσεις, πολύ χαμηλά ποσοστά, 1,6%, 4,1% και 9%καταγράφονται σε μεταβολές 4, 3 και 2 αραιώσεων αντίστοιχα.δ. Το μεγαλύτερο ποσοστό των επαναλήψεων (73,2%) ζητήθηκε μέσα στον πρώτο χρόνο και μάλιστα από αυτό το ποσοστό το 33,3% στο πρώτο τρίμηνο, το 19,7% στο δεύτερο και μόνο το 7,1% τον τρίτο χρόνο από την αρχική μέτρηση. Συμπεράσματα. Η συνεχώς αυξανόμενη συχνότητα αυτοάνοσων νοσημάτων που παρατηρείται παγκοσμίως, σε συνδυασμό με την ραγδαία εξέλιξη της τεχνολογίας και την εφαρμογή νέων μεθοδολογιών ανίχνευσης αυτοαντισωμάτων, έχει οδηγήσει σε αύξηση της ζήτησης του προσδιορισμού αυτών. Στο σημερινό περιβάλλον, όπου υπάρχει μια διάχυτη τάση για μείωση του κόστους υγείας σε όλα τα επίπεδα επιβάλλεται η ορθολογική χρήση των δοκιμασιών αυτών για μια καλύτερη σχέση κόστους/οφέλους, χωρίς βέβαια να γίνεται εις βάρος της βέλτιστης ποιότητας περίθαλψης των ασθενών. Σεβόμενοι τις ανάγκες των κλινικών γιατρών στην καθημέρα κλινική πράξη, καθώς και τις ιδιαιτερότητες του Ανοσολογικού Εργαστηρίου αναφορικά με την χρησιμοποιούμενη μεθοδολογία, προτείνουμε την εφαρμογή κατευθυντήριων οδηγιών ως προς την αναζήτηση των αυτοαντισωμάτων αφενός μεν για την αποφυγή περιττών εργαστηριακών εξετάσεων αφετέρου δε, για την πληρέστερη διαγνωστική προσέγγιση των αυτοάνοσων νοσημάτων.