Επίδραση δεφεριπρόνης σε in vivo μοντέλο αυτόλογης νεφρικής μεταμόσχευσης: πειραματική μελέτη σε χοίρους

Abstract

Introduction: Ischemia-reperfusion syndrome (IRI) represents the major non-immune factor whichleads to renal graft damage. Iron features prominently in IRI processes and several studies haveshown a beneficial role of iron-chelating agent desferoxamine. Another chelating agent deferiprone (L1)has been used in iron overload patients showing better results possibly due to its differentphysicochemical properties. Purpose: The purpose of this study was to assess any possible protective effect of L1 on a kidneyautotransplantation model by studying the damage caused to kidney graft during cold ischemia,reperfusion and post-surgery phases.Material and Method: 14 pigs (65-75kg body weight) were used and consisted the control group (7)and the study group (L1-7). Pigs in L1 group received twice daily 50mg/kg of L1 for 3 consecutive daysplus another dose just before the implantation of graft. Left nephrectomy and graft (left kidney)implantation to right renal vascular pedicle, with concomitant right nephrectomy, were done with anovel experimental model using total extra-peritoneal approaches. In both groups, after left kidneyremoval, it was flushed with Custodiol®solution and immediately was connected to an extracorporealcirculatory machine at 4oC with flow of 50-100ml/min, maintaining fluid (KPS-1®solution) pressure notto exceed 35-40 mmHg, for a period of 4h. Then it was cold stored in Custodiol®solution for another13h (total cold ischemic period: 17h). In L1 group, 0.1gr of L1 were diluted in KPS-1®and Custodiol®solutions. Laboratory and histologic markers of kidney damage were evaluated during a) coldpreservation phase (weight of graft, CK/LDH concentrations into the preservation solution), b) at30mins after reperfusion phase (8-isoprostane, biopsy), c) during post-surgery phase (Urea, Creatserum concentrations) and before sacrifice of animals at 14th postoperative day (biopsy). Biopsyspecimens were examined by two independed pathologists to assess the degree of graft damagethrough the histopathological index and expression of adhesion molecules ICAM-1 and VCAM-1.Results: All animals survived until 14th postoperative day. After 17h cold ischemia period, the meanweight of grafts and CK/LDH concentrations were lower in L1 group compared to control group(p=0.001, p=0.001 and p=0.007, respectively). At 30mins after reperfusion the mean concentration of8-isoprostanes was lower in L1 group compared to control group (p=0.007). Histopathological index at30mins after reperfusion was significantly lower in L1 group compared to control group (p=0.001) andthe same result was seen at 14th postoperative day (p=0.001). Additionally, between 30mins and 14thpostoperative day, the histopathological index was increased in control group (p=0.042), while itremained stable in L1 group (p=0.862). At 30mins after reperfusion, expression of VCAM-1 in L1 groupwas lower compared to L1 group (p=0.02). The same result between two groups was obvious forICAM-1 and VCAM-1 at 14th day (p=0.029 and p=0.04, respectively). ICAM-1 expression was reducedin both groups from 30mins to 14th postoperative day (control group: p=0.034 and L1 group: p=0.034),while VCAM-1 expression remained constant in both groups (control group: p=0.414 and L1 group:p=0.083). From 3rd up to 8th postoperative day Urea serum concentrations and from 3rd up to 7thpostoperative day Creat serum concentrations were constantly lower in L1 group compared to controlgroup (all p<0.05).Conclusions: Due to above promising results, it seems that deferiprone manifests a clearcytoprotective role in renal autotransplantation model by reducing kidney damage both at preservationperiod and after reperfusion, resulting in better graft function during postoperative phase and possiblylowering graft’s immunogenicity.

Εισαγωγή: Η μη ανοσολογικής αρχής ιστική βλάβη του νεφρικού μοσχεύματος, λόγω της υποθερμικής συντήρησής του και του φαινομένου ισχαιμίας-επαναιμάτωσης μετά την εμφύτευσή του, σχετίζεται ευθέως ανάλογα με την πρώιμη και όψιμη λειτουργία του. Ο ελεύθερος εντός των κυττάρων σίδηρος συμμετέχει στη βλάβη αυτή, λόγω του κεντρικού του ρόλου στα φαινόμενα οξειδωαναγωγής και μελέτες με δεσφεροξαμίνη έχουν αποδείξει ένα σχετικά ευεργετικό ρόλο. Η δεφεριπρόνη, λόγω των φυσικοχημικών της ιδιοτήτων, φαίνεται να υπερτερεί της δεσφεροξαμίνης σε ασθενείς με αιμοσιδήρωση, δείχνοντας μεγαλύτερη δυνατότητα διαπερατότητας των κυτταρικών μεμβρανών και πιθανά μεγαλύτερη δέσμευση του ελεύθερου σιδήρου.Σκοπός: Σκοπό της μελέτης αποτέλεσε η διερεύνηση της πιθανής ευεργετικής επίδρασης της δεφεριπρόνης στη μεταμόσχευση νεφρού, μελετώντας τη βλάβη στο νεφρικό μόσχευμα κατά τη ψυχρή ισχαιμία, την επαναιμάτωση και μετεγχειρητικά.Υλικό και Μέθοδος: Χρησιμοποιήθηκαν 14 ενήλικες χοίροι φάρμας (ΣΒ: 65-75kg). Τα 7 πειραματόζωα αποτέλεσαν την ομάδα ελέγχου, ενώ στα υπόλοιπα 7 που αποτέλεσαν την ομάδα μελέτης χορηγήθηκε δεφεριπρόνη ενδοφλεβίως σε δοσολογία 50mg/kg δύο φορές την ημέρα για 3 ημέρες και μία δόση πριν τη μεταμόσχευση. Η αριστερή νεφρεκτομή και η μεταμόσχευση του αριστερού νεφρού στα δεξιά νεφρικά αγγεία, με συνοδό δεξιά νεφρεκτομή, πραγματοποιήθηκαν με ένα καινοτόμο πειραματικό μοντέλο με εξολοκλήρου εξωπεριτοναϊκή προσπέλαση. Το μόσχευμα (αριστερός νεφρός) και στις δύο ομάδες εκπλύθηκε με διάλυμα Custodiol®και αμέσως μετά συνδέθηκε σε μηχανή εξωσωματικής κυκλοφορίας στους 4οC, με ροή στα 50-100ml/min, διατηρώντας την πίεση του διαλύματος KPS-1®κάτω από 35-40mmHg για 4h. Μετά συντηρούταν το μόσχευμα σε υποθερμία σε διάλυμα Custodiol®για 13h (συνολική ψυχρή ισχαιμία: 17h). Στην ομάδα L1, 0,1gr L1 προστέθηκε στα διαλύματαCustodiol®και KPS-1®. Εργαστηριακοί και ιστολογικοί δείκτες νεφρικής βλάβης εκτιμήθηκαν κατά τη διάρκεια α) της ψυχρής συντήρησης (βάρος μοσχεύματος, CK/LDH διαλύματος συντήρησης), β) στα 30mins από την επαναιμάτωση (8-ισοπροστάνια, βιοψία), γ) κατά τη μετεγχειρητική περίοδο(συγκέντρωση ουρίας και κρεατινίνης ορού) και πριν την ευθανασία των πειραματόζωων τη 14η μετεγχειρητική ημέρα (βιοψία). Οι βιοψίες εξετάστηκαν από δύο ανεξάρτητους παθολογοανατόμους για να εκτιμήσουν τη βλάβη του μοσχεύματος μέσω του ιστοπαθολογικού δείκτη και της έκφρασης των μορίων προσκόλλησης ICAM-1 και VCAM-1.Αποτελέσματα: Όλα τα πειραματόζωα επέζησαν μέχρι τη 14η μετεγχειρητική ημέρα. Μετά από 17hψυχρής ισχαιμίας, τόσο το βάρος, όσο και οι συγκεντρώσεις των ενζύμων κυτταρικής βλάβης, ήταν στατιστικά χαμηλότερα στην ομάδα μελέτης, σε σχέση με αυτά της ομάδας ελέγχου (p=0,001 για το βάρος, p=0,001 για την CK και p=0,007 για την LDH, αντίστοιχα). Αντίστοιχα ήταν και τα αποτελέσματα για τη συγκέντρωση των 8-ισοπροστανίων στα 30mins μετά την επαναιμάτωση (p=0,007). Ο ιστοπαθολογικός δείκτης ήταν στατιστικά μικρότερος στην ομάδα μελέτης, σε σχέση με την ομάδα ελέγχου, τόσο στα 30mins από την επαναιμάτωση, όσο και κατά τη 14η μετεγχειρητική ημέρα (p=0,001και p=0,001, αντίστοιχα). Επιπλέον, ενώ αυτός αυξήθηκε στην ομάδα ελέγχου, μεταξύ των 30mins και της 14ης μτχ ημέρας, αντίθετα παρέμεινε σταθερός στην ομάδα μελέτης (p=0,042 και p=0,862,αντίστοιχα). Η έκφραση των μορίων προσκόλλησης ICAM-1 και VCAM-1 κατά την 14η μτχ ημέρα ήταν μικρότερη στην ομάδα μελέτης, σε σχέση με την ομάδα ελέγχου (p=0,029 και p=0,04, αντίστοιχα), ενώ στα 30mins αντίστοιχα μικρότερη ήταν η έκφραση του VCAM-1 (p=0,02). Η έκφραση του ICAM-1 μειώθηκε και στις δύο ομάδες από 30mins στη 14η μτχ ημέρα (ομάδα ελέγχου: p=0,034 και ομάδα μελέτης: p=0,034), ενώ η έκφραση του VCAM-1 παρέμεινε σταθερή και στις δύο ομάδες (ομάδα ελέγχου: p=0,414 και ομάδα μελέτης: p=0,083). Τέλος, από την 3η μέχρι την 8η μετεγχειρητική ημέρα η συγκέντρωση της ουρίας ορού και από την 3η μέχρι την 7η μετεγχειρητική ημέρα η συγκέντρωση της κρεατινίνης ορού ήταν μικρότερες στην ομάδα μελέτης συγκριτικά με την ομάδα ελέγχου (και τα δύοp<0,05).Συμπεράσματα: Η δεφεριπρόνη ασκεί προστατευτική δράση στο νεφρικό μόσχευμα, τόσο κατά τη φάση συντήρησής του, όσο και μετά την επαναιμάτωσή του, με αποτέλεσμα στατιστικά σημαντική βελτίωση της μετεγχειρητικής του λειτουργίας και πιθανά μικρότερης αντιγονικότητας.