Μελέτη in vitro της βιολογικής δραστικότητας των αιωρούμενων σωματιδίων της ατμόσφαιρας με χρήση ευκαρυωτικών και βακτηριακών κυττάρων

Abstract

In this doctoral dissertation, the bioactivity of water soluble and organic extracts of urban particulate matter collected from two different areas of Thessaloniki, an urban traffic and background area, during the winter and summer season, that were divided depended on the size of their diameters in individual fractions was studied. Within the context of the bioactivity of water soluble extracts of PM, their potential cytotoxicity on human lung cells (MRC-5) was initially investigated in vitro by applying the mitochondrial dehydrogenase test (MTT test). After detection of their cytotoxic activity, the LDH assay was performed, which showed that these particles did not induce lysis of the cell membrane of the exposed cells. Subsequently, the potential DNA damage of the exposed cells to the aqueous extracts of PM was examined by the comet assay. Particles of the smallest diameter induced the greatest DNA damage. Then during the doctoral dissertation, the bioactivity of organic extracts of urban particulate matter was studied. Their potential cytotoxicity in MRC-5 cells was initially determined again using the MTT test. The results of released LDH and dye with fluorescent isothiocyanate dextrans when cells were exposed in the organic extracts of the suspended particles showed that the permeability of the cell membrane may change after the exposure of the cells but is not resolved. A study of DNA from exposed MRC-5 cells to organic extracts of PM was followed using both comet assay and determination of the oxidative DNA product, 8-hydroxy-deoxyguanosine (8-OHdG). In fact, DNA damage was observed by both methods and this is also confirmed by the DNA fragmentation isolated from MRC-5 cells, which were exposed to the organic extracts of PM in agarose electrophoresis. Subsequently in the doctoral dissertation, the PARP enzyme was determined. Most protein extracts of exposed MRC-5 cells to organic particle extracts showed an increase in PARP activity. This fact, in combination with morphological cell membrane alterations, DNA fragmentation and Western Blot Analysis, which showed that the PARP enzyme is cleaved by caspases into two fragments (one of 85 and one of 26 kDa) argues about the possible mechanism of apoptosis of MRC-5 cells induced from organic extracts of PM. At a next step of the doctoral dissertation, TNF-α tumor necrosis factor, was determined by ELISA method and its levels were found to be elevated in MRC-5 cells exposed in organic extracts of urban particulate matter. At a subsequent stage of this doctoral dissertation the potential induction of oxidative stress and lipid peroxidation from organic extracts of PM in E.coli bacterial cells were studied, which were found to be higher for particles of the smallest diameter in the urban traffic area. Regarding the mutagenic activity of organic extracts of suspended particles, which was determined by the Ames test, it appeared higher for the POF organic fraction. Finally, when particulate extracts by emission sources were examined, the greatest cytotoxicity and genotoxicity appeared on the organic extracts originated from exhaust gas of diesel cars.

Στην παρούσα διδακτορική διατριβή μελετήθηκε η βιοδραστικότητα των υδατοδιαλυτών και των οργανικών εκχυλισμάτων των αιωρούμενων σωματιδίων που συλλέχθηκαν από δύο διαφορετικές περιοχές της Θεσσαλονίκης, μία περιοχή αστικής κυκλοφορίας και μία περιοχή αστικού υποβάθρου, κατά τη διάρκεια της χειμερινής αλλά και της καλοκαιρινής περιόδου και τα οποία χωρίστηκαν ανάλογα με το μέγεθος της διαμέτρου τους σε επιμέρους κλάσματα. Στα πλαίσια της βιοδραστικότητας των υδατοδιαλυτών εκχυλισμάτων των αιωρούμενων σωματιδίων, αρχικά μελετήθηκε η πιθανή τους κυτταροτοξικότητα με το MTT τεστ σε ανθρώπινα κύτταρα πνεύμονα MRC-5. Αφού διαπιστώθηκε η κυτταροτοξική τους δράση, πραγματοποιήθηκε ο προσδιορισμός της LDH, ο οποίος έδειξε ότι αυτά τα σωματίδια δεν προκαλούν λύση της κυτταρικής μεμβράνης των εκτεθειμένων κυττάρων. Στη συνέχεια εξετάστηκε η πιθανή βλάβη του DNA των κυττάρων τα οποία εκτέθηκαν στα υδατικά εκχυλίσματα αιωρούμενων σωματιδίων με το comet assay κι αυτή βρέθηκε μεγαλύτερη για τα λεπτότερα σωματίδια. Ακολούθησε η μελέτη της βιοδραστικότητας των οργανικών εκχυλισμάτων των αιωρούμενων σωματιδίων. Αρχικά προσδιορίστηκε η πιθανή κυτταροτοξικότητά τους σε κύτταρα MRC-5 χρησιμοποιώντας και πάλι το MTT τεστ. Τα αποτελέσματα της απελευθερωμένης LDH και της βαφής με τα φθορίζοντα ισοθειακυανικά δεξτράνια εκτεθειμένων κυττάρων στα οργανικά εκχυλίσματα των αιωρούμενων σωματιδίων έδειξαν ότι η διαπερατότητα της κυτταρικής μεμβράνης πιθανόν αλλάζει μετά την έκθεση των κυττάρων, αλλά δε λύεται. Ακολούθησε μελέτη του DNA των εκτεθειμένων κυττάρων MRC-5 στα οργανικά εκχυλίσματα των αιωρούμενων σωματιδίων με το comet assay αλλά και με τον προσδιορισμό του οξειδωτικού προϊόντος του DNA, την 8-δεοξυγουανοσίνη (8-OHdG). Πράγματι, παρατηρήθηκαν βλάβες στο DNA και με τις δύο μεθόδους, οι οποίες επιβεβαιώνονται και με τον κατακερματισμό του απομονωμένου DNA κυττάρων MRC-5. Στη συνέχεια της διδακτορικής διατριβής έγινε προσδιορισμός του ενζύμου της PARP. Τα περισσότερα πρωτεϊνικά εκχυλίσματα των εκτεθειμένων κυττάρων MRC-5 σε οργανικά εκχυλίσματα αιωρούμενων σωματιδίων εμφάνισαν αύξηση στη δραστικότητα της PARP. Το γεγονός αυτό σε συνδυασμό με τις μορφολογικές αλλοιώσεις της κυτταρικής μεμβράνης, τον κατακερματισμό του DNA και την ανάλυση με Western Blot, η οποία έδειξε ότι το ένζυμο της PARP διασπάται από τις κασπάσες σε δύο θραύσματα (ένα των 85 κι ένα των 26 kDa) συνηγορούν ως προς τον πιθανό επαγόμενο μηχανισμό απόπτωσης των κυττάρων MRC-5 από τα οργανικά εκχυλίσματα των αιωρούμενων σωματιδίων. Σε ένα άλλο στάδιο της διδακτορικής διατριβής πραγματοποιήθηκε ο προσδιορισμός του παράγοντα νέκρωσης όγκου TNF-α με την μέθοδο ELISA, ο οποίος βρέθηκε αυξημένος στα εκτεθειμένα κύτταρα. Σε ένα επόμενο στάδιο της διδακτορικής διατριβής μελετήθηκε η πιθανή επαγωγή οξειδωτικού στρες και υπεροξείδωσης λιπιδίων από οργανικά εκχυλίσματα αιωρούμενων σωματιδίων σε βακτηριακά κύτταρα E.coli, οι οποίες βρέθηκαν μεγαλύτερες για τα σωματίδια της μικρότερης διαμέτρου στην περιοχή αστικής κυκλοφορίας. Όσον αφορά, τη μεταλλαξιγόνο δράση των οργανικών εκχυλισμάτων των αιωρούμενων σωματιδίων, η οποία προσδιορίστηκε με το Ames τεστ, αυτή εμφανίστηκε μεγαλύτερη για το οργανικό κλάσμα POF. Τέλος, η μεγαλύτερη κυτταροτοξικότητα και γενοτοξικότητα όταν εξετάστηκαν τα εκχυλίσματα σωματιδίων από πηγές εκπομπής, εμφανίστηκε για τα οργανικά εκχυλίσματα σωματιδίων από καυσαέρια πετρελαιοκίνητων αυτοκινήτων.