Υποπυρηνική τοποθέτηση και έκφραση γενετικών τόπων miRNAs στο έμφυτο ανοσοποιητικό σύστημα

Abstract

Numerous studies have addressed the functional importance of miRNAs in the innate immune system, but little is known about the transcriptional regulation of miRNA genes. Here, we sought to investigate the impact of nuclear architecture as an epigenetic mechanism regulating miRNA gene expression. Our experiments on naive and LPS-activated murine macrophages regarding eight miRNA gene loci (miR-181a1b1, miR-181a2b2, miR-181c, miR-142, miR-146a, miR-17-92, miR-155 and miR-let7e) indicated that irrespectively of miRNA gene response to pro-inflammatory stimuli, miRNA genes are perinuclearly distributed. Moreover, their spatial orientation entails their localization on the interphase of their corresponding chromosome territories, in the subnuclear space defined by the edge of their territorial compartment and the nuclear lamina. We show that colocalization of miRNA genes with the nuclear lamina is frequent in the perinuclear compartment of murine macrophages and does not hinder the monoallelic expression of peripherally distributed miRNA genes downstream of TLR4 activation. We also found that DROSHA localized in the perinuclear space in murine macrophages and colocalized with the active form of RNA Polymerase II. We have also revealed an additional functional role exerted by DROSHA in regulating both protein-coding and miRNA genes in the co-transcriptional level. Our study in murine macrophages suggests a mechanism via which active co-transcriptional regulation of miRNA genes in the perinuclear compartment can serve as a mechanism facilitating nuclear export and fast miRNA export to the cytoplasm. Our finding that miRNA genes localize in the nuclear periphery in both murine stem cells and hematopoietic cells, whereas the TNFα locus does not, provides additional support to the functional meaning of miRNA gene loci peripheral localization.

Πληθώρα ερευνητικών εργασιών ανέδειξε τη λειτουργική σημασία των miRNAs στην εύρυθμη λειτουργία του έμφυτου ανοσοποιητικού συστήματος, παρά ταύτα λίγα είναι γνωστά για τους παράγοντες που ρυθμίζουν την έκφραση των microRNA μεταγράφων. Στην παρούσα διατριβή, διερευνήσαμε την επίδραση της υποπυρηνικής οργάνωσης της χρωματίνης ως έναν επιγενετικό μηχανισμό ρύθμισης της γονιδιακής έκφρασης των πρώιμων miRNA μεταγράφων. Τα πειραματικά μας αποτελέσματα σε ενεργοποιημένα με LPS μακροφάγα του ποντικού, για οκτώ γενετικούς τόπους miRNAs (miR-181a1b1, miR-181a2b2, miR-181c, miR-142, miR-146a, miR-17-92, miR-155 and miR-let7e) συσχετιζόμενων βιβλιογραφικά με την ανοσολογική απόκριση, κατέδειξαν πως ανεξάρτητα από τη μεταγραφική ενεργότητα των εν λόγω γενετικών τόπων κατά την επαγωγή της προφλεγμονώδους απόκρισης, η υποπυρηνική τους θέση εντοπίζεται στην περιφέρεια του κυτταρικού πυρήνα. Επιπρόσθετα, η περιφερική αυτή θέση παρουσιάζει μια πολικότητα ως προς τη χρωμοσωμική επικράτεια στην οποία εδράζεται, εντοπιζόμενη μεταξύ της διεπιφάνειας που ορίζεται από τη χρωμοσωμική επικράτεια και το δίκτυο των πυρηνικών λαμινών. Τα πειραματικά μας αποτελέσματα δείξανε επίσης τον συχνό συνεντοπισμό των αλληλομόρφων των miRNA γονιδίων με τις πυρηνικές λαμίνες, ο οποίος δεν βρέθηκε να επιδρά κατασταλτικά στην μονοαλληλική έκφραση των περιφερικά επαγόμενων γονιδίων miRNAs, καθοδικά της ενεργοποίησης του μονοπατιού του TLR4 υποδοχέα. Βρήκαμε επίσης την υπεύθυνη για τη βιογένεση των miRNAs RNάση, DROSHA, να κατανέμεται σε περιφερικές υποπυρηνικές θέσεις και να συνεντοπίζεται σε αυτές με την ενεργή μορφή της RNA πολυμεράσης II. Επίσης, αποδώσαμε στην πρωτεΐνη DROSHA ένα νέο συμμεταγραφικό ρόλο σχετικό με τη ρύθμιση τόσο κωδικών όσο και miRNA γονιδίων. Τα αποτελέσματα της παρούσας διατριβής προτείνουν ένα νέο μηχανισμό συμμεταγραφικής ρύθμισης των miRNA γονιδίων στην πυρηνική περιφέρεια των μακροφάγων του ποντικού, ο οποίος θα μπορούσε να εξυπηρετεί τη γρήγορη έξοδο ώριμων miRNAs στο κυτταρόπλασμα προκειμένου να διενεργήσουν την κατασταλτική τους στόχευση. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν τη διατήρηση της περιφερικής πυρηνικής τοπολογίας μόνο των γονιδίων miRNAs και όχι του προφλεγμονώδους γονιδίου Tnfα κατά τη διαφοροποίηση των βλαστικών κυττάρων του ποντικού σε αιμοποιητικά κύτταρα, ενισχύοντας τη λειτουργική σημασία της περιφερικής θέσης των γονιδίων miRNAs στον πυρήνα των κυττάρων του ποντικού.