Ανίχνευση υπομικροσκοπικών χρωμοσωμικών διαταραχών σε ασθενείς με νοητική υστέρηση αγνώστου αιτιολογίας με τη μέθοδο των μικροσυστοιχιών γενωμικού συγκριτικού υβριδισμού (array-CGH)

Abstract

Intellectual Disability (ID) is a very clinically and genetically heterogeneous neurodevelopmental entity, thus raising difficulties on genetic evaluation and diagnosis. Hitherto, only a few cases are detected by conventional cytogenetic and molecular techniques, while most cases remain undiagnosed and require further investigation.The present study focuses on the clinical application of array-CGH for first time in Greece as a first-tier diagnostic tool for the investigation of genetic basis of unknown etiology ID in order to identify novel pathogenic copy number variations (CNVs) and causal ID genes. All patients were referred for genetic testing by paediatricians, pediatric neurologists and auxologists from various pediatric hospitals in the whole country and/or by private doctors. Overall, 235 patients with variable degrees of ID underwent array-CGH analysis in the Department of Medical Genetics, University of Athens. They had previously undergone a series of other genetic tests (e.g conventional karyotype, X-fra, PWS/AS, RETT etc) which were negative. High resolution 4x180K and 1x244K Agilent oligo-arrays (>170.000 and >236.000 probes respectively, average resolution ~13Kb) were used in this study. On certain cases for the comprehensive evaluation and validation of molecular findings, array-CGH results were confirmed with MLPA or/and were further investigated with immunocytochemistry/immunohistochemistry, methylation-specific PCR, single gene sequencing, or/and microsatellite fragment analysis. 128 clinically significant submicroscopic aberrations were detected in 89/235 patients (57 males, 32 females, mean age 6.25 years) (~38%), explaining partially or totally the pathological phenotype. Pathogenic CNVs involve recurrent and unique genomic rearrangements (deletions and duplications) ranging in size from 0.015 to 18.4Mb at well-known and new susceptibility chromosomal loci (such as 1q44, 2q14.2, 3p25.3, 7p23.2, 7q11.23, 8q24.3, 10q26.3, 22q11.21, Xp22.31 etc). Among clinically relevant genes associated with ID, they are included; C3orf10, FLNA, LIMK1, STX1A, GTF2I, MBD5, BAI3, HERC2P4, PPP4C, CHRM5, COMT, RTN4R, MAOA/MAOB, IL1RAPL1, JARID1C, DOCK8, EHMT1, HDAC2, CYFIP1. From the total of 128 pathological CNVs that were identified and parental screening was also performed, 52 CNVs were de novo and 15 were parentally inherited. In 57 patients 1 pathological CNV was detected, whereas 32 cases had more than 1 pathogenic aberration. Moreover, 26 X-chromosome cryptic rearrangements were detected in 20 males (one familiar case, 1 mosaic). Clinically relevant CNVs involve novel pathogenic imbalances, some of them are overlapping with microdeletion/microduplication cases recorded in DECIPHER and ISCA databases or/and are related with known syndromes with atypical phenotype. Also, 7/235 patients had CNVs of unknown clinical importance (~3%), while remaining cases revealed common Copy Number Polymorphisms (CNPs)(~59%). The significant percent of positive findings might be due to the strict patient selection criteria by the expertised clinical geneticists of Department of Medical Genetics in University of Athens and high resolution microarray platform we used. Clustering and classification of more cases with similar clinical phenotype and chromosomal breakpoints will permit the identification of plausible new ID syndromes and lead to more accurate forecasting and medical interventions. Αrray-CGH is proven reliable and valid providing more precise diagnosis, better genotype-phenotype correlations as well as comprehensive genetic counselling.

Η Νοητική Υστέρηση (ΝΥ) αποτελεί μια πολυπαραγοντική νευροαναπτυξιακή διαταραχή με μεγάλη κλινική και γενετική ετερογένεια που καθιστά δύσκολη τη γενετική εκτίμηση και διάγνωση. Μέχρι σήμερα, λίγες περιπτώσεις διαλευκάνονται με τις συμβατικές κυτταρογενετικές και μοριακές τεχνικές, ενώ οι περισσότερες παραμένουν αδιάγνωστες και απαιτούν περαιτέρω διερεύνηση. Η παρούσα μελέτη επικεντρώνεται στην εφαρμογή -για πρώτη φορά στην Ελλάδα- των μικροσυστοιχιών array-CGH για τη διερεύνηση του γενετικού υποβάθρου της ΝΥ αγνώστου αιτιολογίας προκειμένου να εντοπιστούν κλινικά σημαντικές ποικιλομορφίες αριθμού αντιγράφου (CNVs) και νέα παθολογικά γονίδια. Μελετήθηκαν συνολικά 235 ασθενείς με ποικίλου βαθμού ΝΥ αγνώστου αιτιολογίας με αρνητικό αποτέλεσμα από άλλες γενετικές εξετάσεις (όπως κλασικό καρυότυπο, Χ-Fra, PWS/AS, RETT ,κα) (Eργαστήριο Ιατρικής Γενετικής, ΕΚΠΑ). Όλοι οι ασθενείς παραπέμφθηκαν για γενετικό έλεγχο από παιδιάτρους, παιδονευρολόγους και αναπτυξιολόγους από διάφορα παιδιατρικά νοσοκομεία της χώρας ή/και από ιδιώτες γιατρούς. Χρησιμοποιήθηκαν μικροσυστοιχίες ολιγονουκλεοτιδίων υψηλής διακριτικής ευκρίνειας 4x180K και 1x244K της εταιρίας Agilent (>170.000 και >236.000 ανιχνευτές αντίστοιχα, μέση ευκρίνεια 13Kb). Στις περιπτώσεις που κρίθηκε απαραίτητο για τη αποσαφήνιση και ολοκληρωμένη αξιολόγηση των μοριακών ευρημάτων, τα array-CGH αποτελέσματα επιβεβαιώθηκαν με MLPA ή/και μελετήθηκαν περαιτέρω με ανοσοκυτταροχημεία/ανοσοϊστοχημεία, ειδικό για μεθυλίωση PCR, αλληλούχηση κατά Sanger ή/και ανάλυση απλοτύπων μετά από ανάλυση θραυσμάτων με χρήση μικροδορυφορικών αλληλουχιών (microsatellite fragment analysis). Ανιχνεύθηκαν 128 παθολογικά CNVs σε 89/235 ασθενείς (57 άρρενες, 32 θήλεα, μέση ηλικία 6.25 έτη) (~38%) που εξηγούν μερικώς ή ολικώς το φαινότυπο. Τα παθολογικά CNVs περιλαμβάνουν μοριακές αναδιατάξεις ελλειμμάτων και διπλασιασμών, επανεμφανιζόμενες (recurrent) και μοναδικές (unique-σε ένα μόνο ασθενή), μεγέθους από 0.015Mb έως 18.4Mb σε γνωστούς και νέους υποψήφιους γενετικούς τόπους (όπως 1q44, 2q14.2, 3p25.3, 7p23.2, 7q11.23, 8q24.3, 10q26.3, 22q11.21, Xp22.31 κα). Μεταξύ των σημαντικών γονιδίων που σχετίζονται με ΝΥ περιλαμβάνονται τα C3orf10, FLNA, LIMK1, STX1A, GTF2I, MBD5, BAI3, HERC2P4, PPP4C, CHRM5, COMT, RTN4R, MAOA/MAOB, IL1RAPL1, JARID1C, DOCK8, EHMT1, HDAC2, CYFIP1. Από τα 128 παθολογικά CNVs που εντοπίστηκαν και ελέγχθηκαν οι γονείς, 52 ήταν de novo και 15 γονεϊκής προέλευσης. Σε 57 ασθενείς εντοπίστηκε 1 παθολογικό CNV, ενώ 32 είχαν περισσότερες από 1 παθολογικές αλλαγές. Επιπλέον, ανιχνεύθηκαν 26/128 Χ-φυλοσύνδετες υπομικροσκοπικές αναδιατάξεις σε 20 άρρενες (1 οικογενής περίπτωση, 1 μωσαϊκό). Τα παθολογικά ευρήματα περιλαμβάνουν νέα CNVs, ορισμένα από τα οποία αλληλοεπικαλύπτονται με περιπτώσεις μικροελλειμμάτων/μικροδιπλασιασμών καταχωρημένες στις βάσεις δεδομένων DECIPHER και ISCA ή/και σχετίζονται με άτυπες περιπτώσεις γνωστών συνδρόμων. Επίσης, βρέθηκαν 7/235 ασθενείς με αγνώστου κλινικής σημασίας CNVs (~3%), ενώ οι υπόλοιπες περιπτώσεις αποκάλυψαν κοινές ποικιλομορφίες αριθμού αντιγράφων (Copy Number Polymorphisms, CNPs) (~59%). Το υψηλό ποσοστό των θετικών ευρημάτων μπορεί να αποδοθεί στα αυστηρά κριτήρια επιλογής των ασθενών από τους έμπειρους κλινικούς γενετιστές του Εργαστηρίου Ιατρικής Γενετικής (ΕΚΠΑ) και τη μεγάλη διακριτική ευκρίνεια των μικροσυστοιχιών που χρησιμοποιήθηκαν. Η ομαδοποίηση και ταξινόμηση περισσότερων ασθενών με παρόμοιο κλινικό φαινότυπο και χρωμοσωμικά σημεία θραύσης θα επιτρέψει την ταυτοποίηση νέων συνδρόμων ΝΥ και θα οδηγήσει σε πιο ακριβείς προγνωστικές και ιατρικές παρεμβάσεις. Οι μικροσυστοιχίες array-CGH αποδεικνύονται αξιόπιστο και έγκυρο εργαλείο πρώτης γραμμής για ακριβέστερη διάγνωση, καλύτερη συσχέτιση γονοτύπου-φαινοτύπου και ολοκληρωμένη γενετική συμβουλευτική.