Επιδράσεις επιγενετικών φαρμάκων στα CD3+ CD8+ κυτταρολυτικά κύτταρα ασθενών με καρκίνο

Abstract

OBJECTIVE: This study aimed to investigate the effects of epigenetic drugs on antitumor peptide-specific CD8+ CTL clones isolated from patients with NSCLC and melanoma.MATERIALS AND METHODS: Three peptide-specific CD8+ CTL clones against hTERT and MAGE, isolated from patients with NSCLC and melanoma respectively were enrolled in this study. Four cancer cell lines, EBV transformed B cells and PBMCs were used as antigen presenting and feeder cells. The CTL clones were cultured in the presence of 5-aza-CdR and TSA and the alterations in the phenotypic, lytic, functional characteristics as well as in gene expression were investigated. Lytic capability was determined by standard chromium release assay and cell cycle kinetics was analysed using BrdU uptake. Apoptosis assay was performed using Annexin/7-AAD and the extracellular and intracellular protein expression was determined using flow cytometry. Gene expression was performed using quantitative RT-Real Time PCR.RESULTS: The epigenetic drugs had an immunomodulatory effect on antitumor peptide-specific CTL. It was confirmed that 5-aza-CdR decreased the global DNA methylation level of CTL by 47% and that the subtoxic concentrations did not affect the cell cycle. FAS cell surface expression was found to be increased by 47% whereas no significant change was observed in the expression of CD8, CD25, CD27, CD28, CD57 ,CD62L, CCR7, CD69, CD122, CD127 and CD178. CTL clones cultured in the presence of 5-aza-CdR exhibit a significant decrease in their cytolytic capabilities (up to70%) that is maintained after drug removal and a subsequent cycle of stimulation and culture (up to 90%). The molecular analysis of the clones against hTERT and MAGE determined that 5-aza-CdR increased gene expression with a fold change of 8 and 15.2 for FOXP3, 3.9 and 2.2 for FASL, 5.3 and 1.8 for FAS, 1.8 and 6.1 for TNF, 4.2 and 4.1 for PD-L1, 4.3 and 4.7 for PD-L2 respectively. No significant differences were observed for PERFORIN, GRANZYMEB, IFNG, IL1b, IL10, TNFSF10, TGFb1, TGFb3, TGFbR1, PD-1, SMAD2, SMAD3, SMAD4 and SMAD7. TSA was found to dramatically decrease the clone activation capability (up to 95.3%) in a dose-dependent manner as well as the clone lytic capability (up to 48.3%).CONCLUSION: The effects of epigenetic drugs on antitumor peptide-specific CD8+ CTL clones are multifaceted and it is difficult to produce definitive conclusions. Howbeit, the immunomodulatory effects observed with most prominent being a severely compromised lytic ability against targets presenting tumor peptides, lead to a phenotype with reduced ability to lyse target cancer cells.

ΣΚΟΠΟΣ: Σκοπός της διατριβής ήταν η μελέτη της επίδρασης των επιγενετικών φαρμάκων σε πεπτιδο-ειδικούς CD8+ T-κυτταρολυτικούς κλώνους, ειδικούς για καρκινικά αντιγόνα, απομονωμένους από ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα και μελάνωμα. ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ: Το υλικό της μελέτης αποτέλεσαν 3 πεπτιδο-ειδικοί CD8+ CTL κλωνοι με ειδικότητα έναντι πεπτιδίων της hTERT και του MAGE οι οποίοι απομονώθηκαν από ασθενείς με μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα και μελάνωμα αντίστοιχα. Ως αντιγονοπαρουσιαστικά και κύτταρα τροφοί χρησιμοποιήθηκαν 4 καρκινικές σειρές, B-κύτταρα μετασχηματισμένα με EBV και PBMC. Τα επιγενετικά φάρμακα που χρησιμοποιήθηκαν ήταν η 5-aza-CdR και η TSA. Aναλύθηκε η επίδραση των φαρμάκων στη λυτική ικανότητα των CTL με τη δοκιμασία απελευθέρωσης 51Cr, στον κυτταρικό κύκλο με έλεγχο ενσωμάτωσης BrdU/7-ΑΑD, στην ικανότητα για απόπτωση με Annexin/7-AAD, στην επιφανειακή και ενδοκυττάρια έκφραση πρωτεϊνών με κυτταρομετρία ροής και στη γονιδιακή έκφραση με ποσοτική RT-Real Time PCR. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ: Τα επιγενετικά φάρμακα έχουν ανοσοδιαμορφωτική επίδραση στα αντικαρκινικά πεπτιδο-ειδικά CTL. Διαπιστώθηκε ότι η 5-aza-CdR μειώνει κατά 47% το ποσοστό της ολικής μεθυλίωσης του γενωμικού DNA και ότι οι δόσεις που χρησιμοποιήθηκαν δεν επηρεάζουν τον κυτταρικό κύκλο. Παρατηρήθηκε αύξηση κατά 47% στην επιφανειακή έκφραση FAS, ενώ δεν παρατηρήθηκε σημαντική διαφορά στην έκφραση των CD8, CD25, CD27, CD28, CD57 ,CD62L, CCR7, CD69, CD122, CD127 και CD178. Βρέθηκε σημαντική μείωση της κυτταρολυτικής ικανότητας (έως και 70%). Η μοριακή ανάλυση για τους κλώνους έναντι της hTERT και του MAGE αποκάλυψε ότι η 5-aza-CdR προκαλεί αύξηση της έκφρασης των: FOXP3 κατά 8x και 15.2x, του FASL κατά 3.9x και 2.2x, του FAS κατά 5.3x και 1.8x, του TNF κατά 1.8x και 6.1x, του PD-L1 κατά 4.2x και 4.1x και του PD-L2 κατά 4.3x και 4.7x αντίστοιχα. Δεν παρατηρήθηκαν σημαντικές διαφορές για τα μόρια: PERFORIN, GRANZYMEB, IFNG, IL1b, IL10, TNFSF10, TGFb1, TGFb3, TGFbR1, PD-1, SMAD2, SMAD3, SMAD4 και SMAD7. Η TSA φάνηκε να μειώνει δραματικά την ικανότητα ενεργοποίησης των κλώνων (έως και 95.3%) με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο αλλά και την ικανότητα λύσης των κυττάρων στοχών (έως και 48.3%). ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ: Οι αλλαγές που συντελούνται στα πεπτιδο-ειδικά έναντι του καρκίνου CTL από τα επιγενετικά φάρμακα είναι πολυδιάστατες και είναι δύσκολο να προτείνει κανείς οριστικά συμπεράσματα. Εντούτοις, φαίνεται ότι οι ανοσοδιαμορφωτικές επιδράσεις που παρατηρήσαμε και ειδικά η μείωση της ειδικής λυτικής ικανότητας των CTL οδηγούν σε ένα φαινότυπο με μειωμένη ικανότητα να λύει τα καρκινικά κύτταρα στόχους.