Chromatin dynamics and gene function in mouse embryonic stem cells

Abstract

Molecular regulation of Embryonic Stem Cell (ESC) pluripotency is an ongoing question of strong interest in stem cell research. Additionally, many studies try to decipher the mechanisms that govern ESC neural differentiation and highlight ESCs as a model to study Central Nervous System development. ESCs are characterized by a complex regulatory network, which is crucial for both maintenance of ESC identity and their proper specification. New factors are day-to-day identified as essential regulators and help decoding ESC biology. Groucho Related Gene 5 (GRG5) is a truncated member of the Groucho family in mice. GRG5 function was initially attributed exclusively to antagonism of the co-repressive activity of the other family members (long GRGs). However, later studies have shown that it is a multifunctional protein with important role in different cellular processes and postnatal developmental procedures. Although a previous study has reported Grg5 as direct target of STAT3 in ESCs, its role has not been elucidated yet.This study unveils the role of GRG5 in early development by analyzing its function in embryonic stem cells (ESCs). Using both loss and gain of function approaches it is demonstrated that GRG5 acts as a self-renewal promoting factor in ESCs by regulating the expression of pluripotency and proliferation factors as well as the activity of the Jak/Stat3 signaling pathway. As a result, depletion of GRG5 prompts ESCs to exit from pluripotent state whereas its forced expression enhances ESC self-renewal. Interestingly, GRG5 over-expression (OE) endows cells with transformed cell-like properties and leads to malignant teratoma formation. OE GRG5 teratomas exhibit invasive capacity and contain high frequency of tumor initiating cells suggesting the pro-oncogenic potential of GRG5.Additionally, we delineate GRG5 involvement in neural fate decision by promoting ESC neuroectodermal commitment via Wnt and BMP signaling suppression, pathways that are known to inhibit ESC neural specification. GRG5 role in neurogenesis was further explored and was found to maintain Neural Stem Cell (NSC) self-renewal through positive regulation of SOX2 expression as well as Notch and Jak/Stat3 pathways activity. Furthermore, depletion of GRG5 expression unraveled its requirement for mouse embryonic fibroblasts conversion to induced neurons. Overall, this study defines GRG5 as a stemness factor with executive role in neural fate determination.

Οι ιδιότητες πλειοδυναμίας και αυτοανανέωσης των εμβρυικών βλαστοκυττάρων (ΕΒΚ) τα καθιστούν εξαιρετικό μοντέλο με πληθώρα ερευνητικών και εφαρμοσμένων χρήσεων όπως αναπτυξιακές μελέτες και η αξιοποίησή τους στην αναγεννητική ιατρική. Το μεγάλο εύρος εφαρμογών τους δημιουργεί την ανάγκη για πλήρη αποκωδικοποίηση των ρυθμιστικών μηχανισμών που διέπουν τη λειτουργία τους. Τα ΕΒΚ χαρακτηρίζονται από ένα ιδιαίτερα πολύπλοκο μοριακό δίκτυο που ρυθμίζει τόσο την πλειοδυναμία τους όσο και την ικανότητά τους να διαφοροποιούνται προς συγκεκριμένη κατεύθυνση έπειτα από κατάλληλα ερεθίσματα. Τα τελευταία χρόνια πολλές μελέτες έχουν επικεντρωθεί στη διαδικασία νευρικής διαφοροποίησης των ΕΒΚ λόγω των ομοιοτήτων που παρουσιάζει με την νευρογένεση κατά την ανάπτυξη του εμβρύου, επιτρέποντας τη χρήση τους ως σύστημα μελέτης της ανάπτυξης του Κεντρικού Νευρικού Συστήματος. Νέοι ρυθμιστικοί παράγοντες ανακαλύπτονται με μεγάλη συχνότητα και βοηθούν τη συμπλήρωση του ‘’παζλ’’ της ρύθμισης της κυτταρικής τύχης των ΕΒΚ.Η πρωτεΐνη GRG5 ανήκει στα ‘’ημιτελή’’ μέλη της οικογένειας Groucho στο ποντίκι. Οι πρωτεΐνες της οικογενείας λειτουργούν ως συμπαράγοντες και εμπλέκονται σε διάφορες αναπτυξιακές διαδικασίες με πιο συντηρημένη αυτή της νευρογένεσης. Αρχικά θεωρούνταν ότι η GRG5 λειτουργεί μόνο μέσω ανταγωνισμού της συγκατασταλτικής δράσης των υπόλοιπων GRG πρωτεϊνών. Ωστόσο, επακόλουθες μελέτες έδειξαν ότι πρόκειται για μια πολυ-λειτουργική πρωτεΐνη η οποία έχει ενεργό ρόλο σε διάφορες κυτταρικές και αναπτυξιακές διαδικασίες. Στα ΕΒΚ έχει φανεί ότι η έκφραση του Grg5 γονιδίου ρυθμίζεται θετικά και άμεσα από το μεταγραφικό παράγοντα STAT3, ωστόσο η λειτουργία της GRG5 δεν έχει μελετηθεί περαιτέρω στο σύστημα αυτό.Στο πρώτο μέρος της διατριβής διερευνήθηκε ο ρόλος της πρωτεΐνης GRG5 στα πρώιμα αναπτυξιακά στάδια του ποντικού μέσω μελέτης του ρόλου της στη λειτουργία των ΕΒΚ. Με πειράματα υπο-/υπερ-έκφρασης της GRG5 συσχετίστηκε η λειτουργία της με τη διατήρηση της πλειοδυναμίας των ΕΒΚ. Πιο συγκεκριμένα, δείχθηκε πως η GRG5 συμβάλει στην αυτοανανέωση των EBK μέσω θετικής ρύθμισης της έκφρασης παραγόντων πλειοδυναμίας, συμπεριλαμβανομένων των NANOG, SOX2, c-MYC και KLF4, καθώς και ρυθμιστών του κυτταρικού πολλαπλασιασμού. Επίσης, η GRG5 αποδείχθηκε απαραίτητη για τη φυσιολογική λειτουργία του σηματοδοτικού μονοπατιού Jak/Stat3 που είναι άμεσα συνδεδεμένο με την αδιαφοροποίητη κατάσταση. Ως αποτέλεσμα, η αποσιώπηση της GRG5 στα ΕΒΚ οδηγεί σε απομάκρυνσή τους από την πλειοδύναμη κατάσταση ενώ η υπερέκφραση του ενισχύει την αυτοανανέωσή τους. Επιπρόσθετα, παρατηρήθηκε πως η υπερ-έκφραση της GRG5 προσδίδει στα ΕΒΚ ιδιότητες όμοιες με αυτές των καρκινικών κυττάρων όπως αυξημένο ρυθμό πολλαπλασιασμού, μετάβαση από επιθηλιακή σε μεσεγχυματική κατάσταση και ανοχή στην απόπτωση. Πιο σημαντικό, τα τερατώματα που δημιουργούνται από ΕΒΚ που υπερ-εκφράζουν τη GRG5 χαρακτηρίζονται από διεισδυτική ικανότητα και παρουσία σημαντικού αριθμού αδιαφοροποίητων κυττάρων ικανών να επανασχηματίσουν όγκους. Τα παραπάνω αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι η GRG5 έχει τη δυνατότητα να λειτουργεί ως ογκογονίδιο.Πέραν της λειτουργίας της ως παράγοντας πλειοδυναμίας, στο δεύτερο μέρος της εργασίας μελετήθηκε ο ρόλος της GRG5 στην επιλογή νευρικής κυτταρικής τύχης. Αποδείχθηκε πως η GRG5 παίζει σημαντικό ρόλο στη νευρική διαφοροποίηση των ΕΒΚ μέσω καταστολής των μονοπατιών Wnt και Βmp, τα οποία είναι γνωστό ότι παρεμποδίζουν τη επαγωγή νευροεκτοδέρματος. Κατά συνέπεια, η αποσιώπηση της έκφρασης του γονιδίου Grg5 παρεμποδίζει τη νευρική διαφοροποίηση των EBK ενώ η υπερέκφρασή του την επιταχύνει.Συνεχίζοντας τη μελέτη της εμπλοκής της GRG5 στη νευρογένεση, εξετάστηκε η λειτουργία της στα εμβρυικά νευρικά βλαστικά κύτταρα (ΝΒΚ) και βρέθηκε ότι είναι απαραίτητη για τη διατήρηση της αυτοανανέωσής τους. Η απουσία της GRG5 οδήγησε σε μείωση των επιπέδων έκφρασης παραγόντων βλαστικότητας, της ενεργότητας των μονοπατιών Notch και Jak/Stat3 καθώς και της ικανότητας αυτοανανέωσης και πολλαπλασιασμού των κυττάρων αναδεικνύοντας τη GRG5 ως ένα σημαντικό ρυθμιστή της λειτουργίας των ΝΒΚ. Επιπρόσθετα, στην παρούσα μελέτη δείχθηκε πως η GRG5 έχει ενεργό ρόλο στη διαδικασία παραγωγής νευρικών κυττάρων μέσω επαναπρογραμματισμού σωματικών κυττάρων. Η παρεμπόδιση της έκφρασης της GRG5 δεν επιτρέπει την απευθείας μετατροπή ινοβλαστών σε επαγόμενους νευρώνες. Αυτή η κατηγορία πειραμάτων έχει αναπτυχθεί τα τελευταία χρόνια και θεωρείται ιδιαίτερα υποσχόμενη στον κλάδο της αναγεννητικής Ιατρικής, ωστόσο απαιτείται καλύτερη κατανόηση των ρυθμιστικών τους μηχανισμών. Συμπερασματικά, στη μελέτη αυτή αποδεικνύεται ότι η GRG5 αποτελεί ένα σημαντικό παράγοντα αυτοανανέωσης των βλαστικών κυττάρων με καθοριστικό ρόλο στην επιλογή της νευρικής κυτταρικής τύχης.