Ανάπτυξη μεθόδων προσδιορισμού φαρμάκων με την τεχνική LC-MS για μελέτες βιοϊσοδυναμίας

Abstract

The purpose of the current dissertation is the development and the validation of proper bioanalytical methods with the use of mass spectrometry for bioanalytical and residue limit studies, given their importance for the development of generic drugs. The first part of the study includes the development and the validation of a new method for the determination of drug pramipexole (PPX) in plasma. Pramipexole is included among the most important drug substances against Parkinson’s disease. The new method appeared to be equivalent regarding the sensitivity with already published studies that use more expensive instrumentation such as tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS). The limit of quantitation (LLOQ) of the new method was found to be 0.1 ng/mL. A new compound, amidulpride, was used as internal standard. The method was validated according to the standards of the European Medicines Agency (EMA) and the American drug Administration (FDA) and was suitable to be applied to bioequivalence studies. In the second part of the current study, a new method for the determination of topiramate (TPM) and lamotrigine (LMG) in human plasma, the two most important antiepileptic substances, was developed and validated. Investigation was performed regarding the mass spectra, with the use of two soft ionization sources, electrospray ionization (ESI) and atmospheric pressure chemical ionization (APCI). In the case of the TPM mass spectra adduct ions appeared. As far as the sample pretreatment is concerned, the liquid-liquid extraction technique was applied. Moreover, an important number of extraction and mixtures of them was examined. With the use of the new method the low LLOQ (3.0 ng/mL) that was achieved was comparable to methods that use HPLC-MS/MS analytical systems. The method was validated according to the standards of EMA and FDA. Finally, in the third part, a comparative study was performed between two novel methods for the simultaneous determination of the antibiotics streptomycin (STR) and dihydrostreptomycin (DHSTR) in milk. The first method was based on ion pair chromatography (IP), while the other was based on hydrophilic interaction chromatography (HILIC). During this comparative study, we investigate the influence of the above mentioned chromatographic modes in terms of sensitivity with the use of ionization source ESI. Furthermore, we the two methods was compared regarding the steps of the sample preparation procedure, with the HILIC to be less time consuming and efficient. The comparison of the analytical characteristics of the HILIC method to the IP chromatographic method revealed great superiority due to severe ion suppression phenomenon when ion-pairing reagents are used.

Σκοπός της παρούσας διατριβής είναι η ανάπτυξη και η επικύρωση κατάλληλων μεθόδων με την τεχνική της φασματομετρίας μαζών για μελέτες βιοϊσοδυναμίας και μελέτες καταλοίπων, δεδομένης της σημασίας τους για την ανάπτυξη γενόσημων φαρμάκων με στόχο την αντιμετώπιση σοβαρών ασθενειών. Αρχικά, μελετήθηκε η πραμιπεξόλη (PPX), η οποία αποτελεί σημαντική φαρμακευτική ουσία για την αντιμετώπιση της Νόσου του Πάρκινσον. Η PPX προσδιορίστηκε σε ανθρώπινο πλάσμα. Η νέα μέθοδος παρουσιάζει χαμηλό όριο ποσοτικοποίησης (LLOQ) το οποίο βρέθηκε να είναι 0,1 ng/mL, το οποίο βρίσκεται στο ίδιο επίπεδο με τις αντίστοιχες δημοσιευμένες μελέτες οι οποίες όμως απαιτούν πιο σύνθετη και ακριβή οργανολογία όπως αυτή της συζευγμένης φασματομετρίας μαζών (HPLC-MS/MS). Ως εσωτερικό πρότυπο χρησιμοποιήθηκε η αμισουλπρίδη. Η μέθοδος επικυρώθηκε πλήρως σύμφωνα με τις οδηγίες του Αμερικανικού φορέα Φαρμάκων και Τροφίμων (FDA) και του Ευρωπαϊκού φορέα φαρμάκου (EMA), οπότε και κρίθηκε κατάλληλη να χρησιμοποιηθεί σε μελέτες βιοϊσοδυναμίας και φαρμακοκινητικής. Δεύτερο τμήμα της εργασίας αποτέλεσε η ανάπτυξη και η επικύρωσή μεθόδου για τον ταυτόχρονο προσδιορισμό της τοπιραμάτης (TPM) και της λαμοτριγίνης (LMG) σε ανθρώπινο πλάσμα, δύο σημαντικών αντιεπιληπτικών ουσιών. Κατά την ανάπτυξη της μεθόδου εξετάστηκαν και οι δύο πηγές ιονισμού ηλεκτροψεκασμού (ESI) και χημικού ιονισμού σε ατμοσφαιρική πίεση (APCI) και αξιολογήθηκαν τα φάσματα που ελήφθησαν και στις δύο περιπτώσεις. Ιδιαιτέρως μελετήθηκε η περίπτωση της ΤPM στην οποία εμφανίζονται ιόντα προσθήκης. Ακολούθησε η διερεύνηση της κατεργασίας εκχύλισης κατά την οποία εξετάστηκαν και οι δύο ουσίες με την τεχνική υγρό-υγρό εκχύλισης (LLE) για ένα μεγάλο αριθμό διαλυτών και μιγμάτων διαλυτών. Με αυτή τη μέθοδο επιτεύχθηκαν χαμηλά όρια ποσοτικοποίησης LLOQ (3.0 ng/mL), ανάλογα με αυτά που επιτυγχάνουν μέθοδοι οι οποίες χρησιμοποιούν συστήματα HPLC-MS/MS. Η μέθοδος επικυρώθηκε πλήρως σύμφωνα με τις οδηγίες του FDA και του EMEA, οπότε είναι κατάλληλη να χρησιμοποιηθεί σε μελέτες βιοϊσοδυναμίας και φαρμακοκινητικής.Σε τρίτο στάδιο πραγματοποιήθηκε συγκριτική μελέτη για τον ταυτόχρονο προσδιορισμό των αντιβιοτικών στρεπτομυκίνη (STR) και διυδροστρεπτομυκίνη (DHSTR) σε δείγμα γάλακτος. Η πρώτη μέθοδος βασίστηκε στην χρωματογραφία σύζευξης ιόντων (Ion pair chromatography, ΙΡ) ενώ η δεύτερη βασίστηκε στην χρωματογραφία υδρόφιλης αλληλεπίδρασης (Hydrophilic interaction chromatography, HILIC). Πραγματοποιήθηκε συγκριτική μελέτη ανάμεσα στις δυο μεθόδους, τόσο για την απαιτούμενη κατεργασία του δείγματος όσο και για την επίδραση στο σήμα της πηγής ιονισμού ESI. Η μέθοδος HILIC απαιτούσε διαδικασία προκατεργασίας δείγματος με λιγότερο αριθμό σταδίων σε σχέση με την αντίστοιχη διαδικασία για την ΙΡ μέθοδο. Επιπλέον, η μέθοδος HILIC παρουσιάζει αυξημένη ευαισθησία 80 και 210 φορές στη STR και τη DHSTR σε σχέση με την μέθοδο IP. Ωστόσο και οι δυο μέθοδοι κρίνονται κατάλληλοι για την χρήση τους σε μελέτες καταλοίπων κτηνιατρικών σκευασμάτων.