Μελέτη της πολυμορφίας του HCV στην Ελλάδα: αναζήτηση σπανίων στελεχών και μέθοδοι προσδιορισμού τους

Abstract

The discovery of the HCV virus as the etiologic factor for the non A, non B hepatitis cases, led to the development of many methods and technologies for its detection and identification. HCV is a flavivirus and its genome is a single stranded RNA molecule which encodes for a polyprotein which provides the structural and non structural proteins of the virus. The target cells for HCV are the hepatocytes as well as B and T lymphocytes, dendritic and mononuclear cells which the virus enters throygh endocytosis. Although the immune system manages to clear the virus a large number (80-85%) of patients become chronic carriers from which about 5-25% will develop chirrossis, end stage liver disease and hepatocellular carcinoma.HCV has a great genetic diversity, is spread worldwide having infected more than 150 million of people and is classified in seven major genotypes and many subtypes. The detection and quantification of thw HCV RNA are valuable tools for monitoring the chronic infection and the outcome of the therapy. Furthermore, knowing the genotype with which a patient is infected is crucial for the choice of the therary regimen. The aim of this study was to develop two in house methods a) for the detection and quantification of the HCV RNA and b) for the determination of the genotype in order to study the diversity of HCV in Greece.For the quantification method we targeted at the 3’UTR end of the genome in contrast to all the commercially available methods which target the 5’end. After experimenting with different types of reagents and enzymes and on different platforms we finally chose the technology of one step real time RT PCR on the Light Cycler platform (Roche). The method was validated with international standards and was evaluated with two commercially available methods from Abbott and Roche with excellent results. The method is quick, reliable and low cost and can be further developed.For the HCV genotyping we developed a method based on the sequencing of the NS5B region of the genome. We designed primers and tried many PCR protocols. The obtained sequences were analysed with phylogenetic analysis methods. The method was validated with international standards and was certified by ΕΣΥΔ. With this method we genotyped most of the undetermined samples (by other methods) in our lab and mainly we studied the HCV dispersal pattern among IDUs (intravenous drug users) in Athens as part of the “Aristotle” programme.

Η ανακάλυψη και ταυτοποίηση του ιού HCV ως τον αιτιολογικό παράγοντα των περιστατικών μη-Α, μη-Β ηπατίτιδας ήταν η αρχή για την ανάπτυξη διαφόρων μεθόδων και τεχνολογιών για την ανίχνευση και τυποποίησή του. Ο ιός HCV ανήκει στην οικογένεια Flaviviridae, γένος hepacivirus και το γονιδίωμά του είναι μονόκλωνο RNA θετικής πολικότητας που κωδικοποιεί μια πολυπρωτεϊνη από την οποία προκύπτουν οι δομικές και οι μη δομικές πρωτεϊνες του. Κύτταρα-στόχοι του ιού – στα οποία εισέρχεται με ενδοκύτωση μετά από πρόσδεση σε ειδικούς υποδοχείς- είναι τα ηπατοκύτταρα αλλά αναφέρονται και τα λεμφοκύτταρα (Β και Τ) καθώς και τα δενδριτικά και τα μονοκύτταρα. Παρόλο που το ανοσοποιητικό σύστημα καταφέρνει να περιορίσει τη λοίμωξη και να οδηγήσει σε αυτοϊαση, εντούτοις ένα μεγάλο ποσοστό ασθενών (80-85%) μεταπίπτουν σε χρονιότητα από τους οποίους το 5-25% θα φθάσουν σε στάδιο κίρρωσης διατρέχοντας τον κίνδυνο εμφάνισης ηπατικής νόσου τελικού σταδίου και ηπατοκυτταρικό καρκίνο. Ο ιός HCV παρουσιάζει μεγάλη γενετική ετερογένεια, έχει παγκόσμια εξάπλωση και έχει μολύνει πάνω από 150 εκ. ανθρώπους στην υφήλιο. Διακρίνεται σε 7 γονότυπους και πολλούς υπότυπους.Η ανίχνευση και ο ποσοτικός προσδιορισμός του HCV RNA δίνουν πολύτιμες πληροφορίες τόσο για τη διάγνωση της χρόνιας λοίμωξης όσο και για την παρακολούθηση της πορείας της θεραπείας. Επιπλέον, η γνώση του γονότυπου του ιού με τον οποίο είναι μολυσμένος ο ασθενής καθορίζει τη δόση και τη διάρκεια του θεραπευτικού σχήματος και αποτελεί πολύτιμο εργαλείο για την παρακολούθηση και τη δυναμική της επιδημίας της ηπατίτιδας C σε διάφορους πληθυσμούς.Σκοπός της παρούσας διατριβής ήταν η ανάπτυξη in-house μεθόδων α) για την ανίχνευση και τον ποσοτικό προσδιορισμό του HCV RNA και β) για τον προσδιορισμό του γονότυπου του ιού HCV προκειμένου να μελετηθεί η πολυμορφία του HCV στην Ελλάδα.Σε ότι αφορά στη μέθοδο του ποσοτικού προσδιορισμού του HCV RNA στοχεύσαμε το 3΄άκρο του γονιδιώματος του ιού σε αντίθεση με όλες τις εμπορικά διαθέσιμες μεθόδους που βασίζονται στην ενίσχυση του 5΄άκρου. Μετά από πολλές δοκιμές με διάφορες πλατφόρμες και συνδυασμούς αντιδραστηρίων τελικά καταλήξαμε στη χρησιμοποίηση της τεχνολογίας της one step real time PCR (αλυσιδωτή αντίδραση της πολυμεράσης πραγματικού χρόνου σε ένα βήμα) στην πλατφόρμα Light Cycler (Roche) και η αξιοπιστία της μεθόδου ελέγχθηκε τόσο με διεθνή standards όσο και με τη σύγκρισή της με δύο εγκεκριμένες εμπορικές μεθόδους των εταιρειών Abbott και Roche. Έτσι δημιουργήθηκε μια μέθοδος που είναι γρήγορη, αξιόπιστη και χαμηλού κόστους και η οποία μπορεί να βελτιωθεί περαιτέρω.Σε ότι αφορά στη μέθοδο γονοτύπησης η μέθοδος που αναπτύχθηκε ήταν ο άμεσος προσδιορισμός της αλληλουχίας με τη διαδικασία του sequencing που αποτελεί και τη μέθοδο αναφοράς. Αρχικά σχεδιάστηκαν εκκινητές (primers) από την πολύ καλά συντηρημένη περιοχή NS5B του ιού και δοκιμάστηκαν διάφορα πρωτόκολλα PCR (αλυσιδωτής αντίδρασης της πολυμεράσης). Ακολούθησε η διαδικασία του sequencing για τη λήψη των αλληλουχιών οι οποίες στη συνέχεια επεξεργάζονταν με μεθόδους φυλογενετικής ανάλυσης. Η μέθοδος αξιολογήθηκε με διεθνή πρότυπα και έλαβε πιστοποίηση από το ΕΣΥΔ. Με τη μέθοδο αυτή τυποποιήθηκαν τα περισσότερα δείγματα που ήταν απροσδιόριστα (με τη μέθοδο του αντίστροφου υβριδισμού (LiPA)) στο εργαστήριό μας και ήταν η μέθοδος με την οποία μελετήθηκε η δυναμική της επιδημίας της ηπατίτιδας C σε ΧΕΝ (χρήστες ενδοφλεβίων ναρκωτικών) στα πλαίσια του προγράμματος «Αριστοτέλης» τα δεδομένα της οποίας δημοσιεύτηκαν σε έγκυρο επιστημονικό περιοδικό.