Molecular characterization of temephos resistance in the major dengue and chikungunya vector Ae.albopictus

Abstract

Diseases transmitted by mosquitoes, like malaria, dengue, zika, yellow fever e.t.c are a major cause of human suffering resulting every year in mortality and morbidity at a global scale with a large socio-economical impact. The main way to prevent these diseases is to control the population size of mosquitoes and the most efficient and widely used method for that remains the use of insecticides. However, insecticide resistance is being selected in mosquito populations threatening the efficiency of insecticide based interventions. As a limited number of different insecticide classes are available it is highly important to design efficient insecticide resistant management strategies to overcome this major problem. A prerequisite for that is to understand the molecular mechanisms conferring resistance in order to make evidence based decisions. In this PhD we have investigated the molecular mechanisms conferring resistance against the organophosphate larvicide temephos in Ae. albopictus, one of the most invasive species found worldwide and a major vector of arboviral diseases like dengue and chikungunya. Increased esterase activity was associated with the resistance phenotype and a new generation sequencing analysis revealed the up-regulation of several detoxification enzymes in the resistant strain, with the two esterases CCEae3a and CCEae6a being among the most prominent. The genes of these two esterases were also found to be amplified in the resistant strain, explaining at least partially their transcriptional up-regulation and their amplification was further linked to the resistance phenotype through genetic crosses. Subsequently CCEae3a from Ae.albopictus and Ae.aegypti (CCEae3a was associated with temephos resistance also in this vector) was expressed using the baculovirus expression system and used to characterize its interaction with temephos-oxon, the toxic form of the insecticide. The kinetic constants of their interaction were estimated showing a high binding affinity of CCEae3a for temephos-oxon accompanied by a very slow hydrolysis rate, which is characteristic for the sequestration resistance mechanism. The tissue localization of CCEae3a was also investigated in Ae.albopictus larvae through western blots and immunochistochemistry experiments, showing its localization in malpigian tubules and the nerve cord, the target tissue of organophosphate insecticides. Finally the geographical distribution and evolutionary origin of the amplified esterase locus was investigated in individuals collected from 16 different countries. Amplification of both esterases was found in collections from Greece and Florida (U.S.A) representing a single amplification event that has spread between the two countries through passive transportation of this disease vector. A second and independent amplification event involving amplification of CCEae3a only was also detected in individuals from Florida.

Οι ασθένειες που μεταδίδονται από κουνούπια όπως η ελονοσία, ο δάγκειος πυρετός, ο ιός Ζίκα, ο κίτρινος πυρετός κ.ά αποτελούν ένα από τα βασικότερα προβλήματα που αντιμετωπίζει η ανθρωπότητα σήμερα, καθώς πλήττουν εκατομμύρια ανθρώπους κάθε χρόνο και προκαλούν τεράστιες κοινωνικο-οικονομικές επιπτώσεις. Ο κύριος τρόπος καταπολέμησης των ασθενειών αυτών είναι η μείωση του αριθμού των κουνουπιών-φορέων, και πιο αποτελεσματική μέθοδος προς την κατεύθυνση αυτή έχει αποδειχτεί μέχρι τώρα η χρήση εντομοκτόνων ουσιών. Παρόλα αυτά, η εκτεταμένη και συχνά αλόγιστη χρήση των εντομοκτόνων έχει οδηγήσει στην επιλογή ανθεκτικότητας στις ουσίες αυτές, διακινδυνεύοντας την αποτελεσματικότητα των προγραμμάτων καταπολέμησης των κουνουπιών. Καθώς ο αριθμός των διαφορετικών εγκεκριμένων προς χρήση δραστικών ουσιών είναι περιορισμένος, καθίσταται αναγκαία η ανάπτυξη στρατηγικών για την αποφυγή εμφάνισης ανθεκτικότητας σε αυτές τις λίγες ουσίες. Απαραίτητη προϋπόθεση για την ανάπτυξη και εφαρμογή αποτελεσματικών στρατηγικών καταπολέμησης της ανθεκτικότητας που να βασίζονται σε επιστημονικά στοιχεία είναι η γνώση της μοριακής βάσης της ανθεκτικότητας. Στη συγκεκριμένη διδακτορική διατριβή διερευνήθηκαν οι μοριακοί μηχανισμοί ανθεκτικότητας του κουνουπιού τίγρης, Ae.albopictus στο οργανοφοσφωρικό προνυμφοκτόνο temephos. Ο φαινότυπος της ανθεκτικότητας συσχετίστηκε με αυξημένη ενεργότητα εστερασών, και η ακόλουθη ανάλυση μεταγραφικών επιπέδων έδειξε υπερ-έκφραση διαφόρων ενζύμων αποτοξικοποίησης στο ανθεκτικό στέλεχος, συμπεριλαμβανομένων των εστερασών CCEae3a και CCEae6a. Στη συνέχεια βρέθηκε ότι στο γονιδίωμα του ανθεκτικού στελέχους τα δύο αυτά γονίδια έχουν πολλαπλασιαστεί, εξηγώντας μερικώς τουλάχιστον την υπερ-έκφραση τους. H παρουσία περισσότερων γονιδιακών αντιγράφων συσχετίστηκε περεταίρω με τον φαινότυπο της ανθεκτικότητας, μέσω γενετικών διασταυρώσεων. Η εστεράση CCEae3a εκφράστηκε σε ετερόλογο σύστημα έκφρασης και χαρακτηρίστηκαν οι κινητικές παράμετροι της αλληλεπίδρασης της με την τοξική μορφή του εντομοκτόνου, δείχνοντας ότι προσδένεται γρήγορα στο εντομοκτόνο απορροφώντας το σαν σφουγγάρι και παραμένοντας προσδεδεμένη σε αυτό για μεγάλο χρονικό διάστημα. Επίσης, μελετήθηκε η παρουσία της εστεράσης CCEae3a σε συγκεκριμένους ιστούς της προνύμφης του κουνουπιού μέσω πειραμάτων αποτύπωσης Western και ανοσοϊστοχημείας, φανερώνοντας τον εντοπισμό της στα μαλπιγκιανά σωληνάρια και τη νευρική χορδή, η οποία αποτελεί τον ιστό-στόχο των οργανοφωσφορικών εντομοκτόνων. Τέλος, μελετήθηκε η γεωγραφική εξάπλωση και προέλευση του πολλαπλασιασμού του γονιδιακού τόπου των εστερασών CCEae3a-CCEae6a σε άτομα Ae.albopictus προερχόμενα από 16 διαφορετικές χώρες. Άτομα με γονιδιακό πολλαπλασιασμό και των δύο εστερασών εντοπίστηκαν στην Ελλάδα και την Φλόριντα των Η.Π.Α αντιπροσωπεύοντας το ίδιο γεγονός πολλαπλασιασμού που μεταφέρθηκε μεταξύ των δύο χωρών μέσω παθητικής μεταφοράς ατόμων. Στην Φλόριντα βρέθηκαν όμως και άτομα με γονιδιακό πολλαπλασιασμό μόνο της CCEae3a, πράγμα που αντιπροσωπεύει ένα δεύτερο, ξεχωριστό γεγονός πολλαπλασιασμού.