Διερεύνηση της παράδοξης δράσης των εχινοκανδινών εναντίον των υφομυκήτων του γένους Aspergillus

Abstract

Aspergilli are saprophytic hyphomycetes that pose a lethal threat to the immunocompromised patients. Echinocandins are a new category of potent antifungal agents against Aspergilli in vivo; however they have mediocre in vitro activity against these fungi. This dissertation is trying to dissect the mechanisms that cause this lag in the in vitro and the in vivo activity of these antifungal agents against Aspergilli.The susceptibility tests of 6 Aspergillus strains to antifungals showed that caspofungin demonstrates an increased activity in the cell culture medium that resembles the conditions found in the organisms of patients infected with Aspergillus; this is not the case with voriconazole. This increased activity is documented by the smaller MECs and EC50s in those conditions. In a series of experiments performed in order to find the factor that mediates this lag in the caspofungin activity in the two different media, FCS and more specifically BSA was found to mediate this effect. This was confirmed with scanning electron microscopy experiments that extensively described the damage at the hyphae and the hyphal tips. Next, confocal microscopy experiments showed that BSA is bound on Aspergilli, mostly at the germinating forms, and that caspofungin binds more at the surface of the fungi in the presence of BSA, while the increased caspofungin mediated b-glucan exposure is even higher when BSA is present in the medium. Surprisingly, the abovementioned phenotype was not confirmed with anidulafungin or micafungin.The experiments described in this dissertation show that caspofungin activity is increased in a cell culture medium that resembles more the physiologic conditions in the tissues of patients infected with Aspergilli. This increased caspofungin activity, as shown in this dissertation, is associated with the increased BSA binding on the fungal cell wall of Aspergillus, especially in the germinating forms of the fungus. In the presence of caspofungin, BSA binding on the fungal cell wall is even more increased and in the presence of BSA, caspofungin binding on the fungal cell wall is increased, implying the possibility of BSA acting as a carrier molecule for caspofungin, leading in a positive feedback loop. Furthermore, since one of the current explanations of the lag in the in vivo and the in vitro activity of echinocandins in the literature is the caspofungin induced increased b-glucan exposure on the fungal cell wall surface, we performed confocal microscopy experiments to Aspergillus fumigatus exposed to increasing caspofungin concentrations and found that when the fungus had been exposed to BSA, b-glucan exposure was higher. These two mechanisms could explain the lag in the in vivo and the in vitro activity of echinocandins.

Οι μύκητες του γένους Aspergillus αποτελούν θανάσιμο κίνδυνο για ασθενείς με ανοσοκαταστολή. Οι εχινοκανδίνες είναι αντιμυκητικά φάρμακα με αξιόλογη in vivo δραστικότητα εναντίον των μυκήτων αυτών, αλλά μέτρια δράση εναντίον τους in vitro. Η παρούσα διδακτορική διατριβή, προσπαθεί να διερευνήσει τους μηχανισμούς που προκαλούν αυτή τη διαφορά ανάμεσα στην in vitro και την in vivo δραστικότητα των εχινοκανδινών εναντίον των Ασπεργίλλων.Πραγματοποιήθηκαν test ευαισθησίας σε κασποφουγκίνη και βορικοναζόλη σε 6 στελέχη του γένους Aspergillus, και παρατηρήθηκε πως η κασποφουγκίνη έχει αυξημένη δράση εναντίον τους σε θρεπτικό υλικό κυτταροκαλλιεργειών που προσομοιάζει σε συνθήκες ανθρώπινου οργανισμού, πράγμα που δε συμβαίνει με τη βορικοναζόλη. Αυτή η αυξημένη δράση συνίσταται σε μικρότερες MEC και EC50 για την κασποφουγκίνη. Σε μια σειρά πειραμάτων που έγιναν για να βρεθεί ποια ουσία εντός του θρεπτικού υλικού σχετίζεται με αυξημένη δραστικότητα της κασποφουγκίνης, βρέθηκε πως αυτή ήταν ο βόειος ορός, και πιο συγκεκριμένα, η βόειος αλβουμίνη, πράγμα το οποίο επιβεβαιώθηκε και με ηλεκτρονικό μικροσκόπιο, όπου αναδείχθηκαν οι δομικές βλάβες στο τοίχωμα των μυκήτων. Μετά, έγιναν περαιτέρω πειράματα, αυτή τη φορά υπό συνεστιακό μικροσκόπιο, που έδειξαν πως η βόειος αλβουμίνη συνδέεται στους μύκητες του γένους Aspergillus, αλλά περισσότερο στις βλασταίνουσες μορφές του, και πως η κασποφουγκίνη συνδέεται περισσότερο στη επιφάνεια των μυκήτων παρουσία αλβουμίνης, ενώ και η αυξημένη έκθεση της β-γλουκάνης παρουσία κασποφουγκίνης είναι μεγαλύτερη όταν στο περιβάλλον υπάρχει βόειος ορός. Παραδόξως, ο ανωτέρω περιγραφείς φαινότυπος δεν επιβεβαιώθηκε με την ανιδουλαφουγκίνη και τη μικαφουγκίνη.Τα πειράματα που περιγράφονται στην παρούσα διδακτορική διατριβή δείχνουν πως η δράση της κασποφουγκίνης αυξάνεται περισσότερο σε θρεπτικό υλικό κυτταροκαλλιεργειών, που προσομοιάζει στις συνθήκες που επικρατούν στους ιστούς ασθενών με Ασπεργίλλωση. Αυτή η αυξημένη δράση της κασποφουγκίνης, σχετίζεται με την αυξημένη ικανότητα που έχει η αλβουμίνη να συνδέεται πάνω στο τοίχωμα του μύκητα Aspergillus, ιδίως όταν αυτός βρίσκεται σε φάση βλάστησης και όχι στο στάδιο των κονιδίων σε κατάσταση αδρανείας. Παρουσία κασποφουγκίνης, η πρόσδεση της αλβουμίνης είναι μεγαλύτερη, αλλά και παρουσία αλβουμίνης η πρόσδεση της κασποφουγκίνης είναι μεγαλύτερη, φαινόμενο που πιθανόν σημαίνει πως μπορεί η αλβουμίνη να δρα ως μόριο-μεταφορέας της κασποφουγκίνης πάνω στο τοίχωμα του μύκητα, αυξάνοντας έτσι τη δράση της και οδηγώντας σε έναν θετικά ανατροφοδοτούμενο κύκλο. Επιπλέον, δεδομένου ότι στη βιβλιογραφία έχει προταθεί ως ερμηνεία της διαφοράς στην in vivo και την in vitro δράση των εχινοκανδινών η αυξημένη έκθεση της β-γλουκάνης στο τοίχωμα των μυκήτων του γένους Aspergillus μετά από έκθεση στις εχινοκανδίνες, πραγματοποιήθηκαν πειράματα ελεγχόμενα με συνεστιακή μικροσκοπία σε Ασπέργιλλο που είχε εκτεθεί σε αυξανόμενες συγκεντρώσεις κασποφουγκίνης και παρατηρήθηκε πως όταν ο μύκητας είχε εκτεθεί σε βόειο ορό, η έκθεση της β-γλουκάνης ήταν μεγαλύτερη. Αυτοί οι δύο μηχανισμοί θα μπορούσαν να εξηγούν τη διαφορά στην in vivo και την in vitro δραστικότητα της κασποφουγκίνης.