Λοιμογόνος δράση του παράγοντα CagA του ελικοβακτηριδίου του πυλωρού: μελέτη του ρόλου των θέσεων φωσφορυλίωσης EPIYA στην επαγωγή ιντερλευκίνης-8 και μορφοκινητικών αλλαγών στα γαστρικά επιθηλιακά κύτταρα

Abstract

Helicobacter pylori (H. pylori) is a Gram negative bacteria that infects approximately 50% of thepopulation in Greece. The majority of the carriers (80-90%) develops chronic active gastritis andremain mainly asyptomatic, however, 10-18% will develop gastric or duodenal ulcer and 1-2% willdevelop gastric adenocarcinoma and MALT lymphoma. The outcome of H. pylori infection isdetermined by the genetic predisposition of the host, environmental and nutritional factors as well asparticular bacterial virulence factors.H. pylori virulence factors can be classified into three categories, membrane-bound, secretedand injected. The last category encompasses the CagA endotoxin, which is injected inside the gastricepithelial cells via a bacterial type IV secretion system. Once inside CagA is phosphorylatedhierarchically at the carboxy terminus, by c-Abl and c-Src intracellular kinases, on tyrosine residuesinvolved in repeating Glutamate-Proline-Isoleucine-Tyrosine- Alanine (Glu-Pro-Ile-Tyr-Ala, EPIYA)motifs. These motifs are found in strains isolated from patients of Western populations (Europe, N. America, and Australia) in three distinct types (EPIYA-A, EPIYA-B and EPIYA-C). The number ofEPIYA-A and EPIYA-B usually, remains constant, while the EPIYA-C shows high variability betweenstrains and it has been proposed to determine virulence levels of the CagA protein, since the risk fordeveloping gastric cancer increases in direct proportion to the number of EPIYA -C motifs. Followingintracellular phosphorylation of CagA the protein has been reported to interact with a plurality ofmolecules of the host cell and has been suggested to disrupt a wide number of signaling pathways,which regulate a number of functions relating to cancer development such as, cellular polarity andmetastasis, as well as, proliferation and apoptosis. Some of these interactions seem to be linked toCagA EPIYA phosphorylation at the carboxy terminus and others are phosphorylation-independent.A key manifestation of H. pylori infection is the generation of active gastritis, demonstrated byavid infiltration of neutrophils in the gastric lamina propria. The main neutrophil chemotactic factor isInterleukin 8 (IL-8) and the molecular mechanism through which H. pylori infection contributes to IL-8secretion by gastric epithelial cells remains highly controversial. Initially, it has been reported to bedependent on the presence of a functional type IV secretion system, independent of CagA activity,however, much later IL-8 transcriptional activation and secretion has been shown to depend on CagAactivity and on other secreted bacterial virulence factors.The aim of this dissertation was the study of mechanisms by which the CagA protein is involvedin the development of gastric inflammatory response and it was conducted in two phases, first anepidemiologic analysis of clinical isolates and secondly with the use of experimental H. pylori infectionmodels.In the epidemiologic study, H. pylori clinical isolates from symptomatic patients in Cambodiawere analyzed with respect to their polymorphic CagA and VacA elements and correlated to theseverity of histopathological lesions and the clinical manifestations of the disease. Through this study,we were able to show that there was an expansion of European Western-type-like vacA and cagAalleles to East-Asian H. pylori strains in Cambodia, thereby providing an explanation for the lowergastric cancer levels reported in this country, compared to other neighboring East Asian Countries.This particular study was a continuation of similar studies conducted in the past involving symptomaticGreek patients (Panayotopoulou Ε. Et al. 2007, Sgouras D. et al. 2009, Panayotopoulou Ε. et al. 2010),which are not part of this dissertation but were materialized with the help of the author of thisdissertation.In the second phase of the study we analyzed the importance of the repeating EPIYA motifs inthe carboxyterminal end of CagA protein in the molecular mechanism, leading to the transcriptionalactivation of IL-8 and the development of chronic active gastritis, utilizing experimental H. pyloriinfection systems. For this purpose we generated a number of H. pylori CagA mutant strainsexpressing CagA protein with a variable number of functional EPIYA-C, and the respective nonphosphorylatableEPIFA motifs within the same genetic background based on P12 reference H. pyloristrain.We then utilized these strains to infect gastric epithelial cell lines and studied the transcriptionalactivation, as well as, secreted levels of IL-8 which were found to be strictly depended on thefunctionality of EPIYA-C phosphorylation motifs. Moreover, levels of IL-8 transcriptional activation, as well as, secreted levels of IL-8 were found to be the same regardless of the number of EPIYA-Crepeats, following activation of NF-kB. Regarding the signaling pathways leading to NF-kB activation,early ERK1/2 and AKT activation was found to be independent of EPIYA-C phosphorylation. However,inhibition of TAK1 kinase, either chemically through the use of specific TAK1 inhibitor 5Z-7-Oxozeaenol, or genetically, through the use of TAK1-/- mouse embryonic fibroblasts (MEFs), within ourexperimental H. pylori infection models resulted in complete inhibition of the secretion of IL-8, in adose-dependent manner, regardless of the presence of the CagA. Finally, we were able to demonstratethat CagA and TAK1 partake within the same activation complex, as they were found toimmunoprecipitate together and that this interaction did not involve the protein segmentsencompassing the EPIYA-C motifs.

Στην Ελλάδα μεσοσταθμικά, 50% του πληθυσμού είναι φορέας λοίμωξης Helicobacter pylori (H.pylori) το οποίο αποτελεί τον κύριο αιτιολογικό παράγοντα εκδήλωσης χρόνιας ενεργού γαστρίτιδας. Το 80-90% των ασθενών παραμένουν ασυμπτωματικοί, το 10-18% θα εκδηλώσουν την νόσου του πεπτικού έλκους, το 1% θα αναπτύξει γαστρικό αδενοκαρκίνωμα ενώ περίπου το ίδιο ποσοστό θα αναπτύξει λέμφωμα MALT. Η έκβαση της λοίμωξης από H. pylori καθορίζεται από τους πολυμορφισμούς του ξενιστή, από περιβαλλοντικούς παράγοντες και από παράγοντες παθογένειας του βακτηρίου.Οι παράγοντες παθογένειας του H. pylori μπορούν να καταταχθούν σε τρεις κατηγορίες, στους μεμβρανικούς, στους εκκρινόμενους και στους μεταφερόμενους. Στους τελευταίους ανήκει η ενδοτοξίνη CagA η οποία μεταφέρεται στο εσωτερικό των γαστρικών επιθηλιακών κυττάρων μέσω ενός βακτηριακού συστήματος μεταφοράς τύπου ΙV. Μετά την είσοδο της η CagA φωσφορυλιώνεται στο καρβοξυτελικό της άκρο, από τις κινάσες του κυττάρου c-Abl και c-Src ιεραρχικά, σε κατάλοιπα τυροσίνης που συμμετέχουν σε επαναλαμβανόμενα μοτίβα της μορφής Γλουταμινικό-Προλίνη-Ισολευκίνη-Τυροσίνη-Αλανίνη (Glu-Pro-Ile-Tyr-Ala, EPIYA). Τα μοτίβα αυτά απαντώνται σε Δυτικούς πληθυσμούς (Ευρώπη, Β. Αμερική, Αυστραλία) σε τρείς διακριτούς τύπους (EPIYA-Α, EPIYA-Β καιEPIYA-C). Ο αριθμός των θέσεων EPIYA-Α και EPIYA–Β παραμένει σταθερός, ενώ των EPIYA-Cεμφανίζει υψηλή ποικιλομορφία μεταξύ των στελεχών, καθορίζοντας τα επίπεδα λοιμογονικότητας της πρωτεΐνης CagA, δεδομένου ότι ο κίνδυνος για ανάπτυξη γαστρικού καρκίνου αυξάνει ευθέως ανάλογα με τον αριθμό των θέσεων EPIYA-C. Μετά την φωσφορυλίωση της, η CagA έχει βρεθεί να αλληλεπιδρά με πλειάδα μορίων του κυττάρου ξενιστή και να διαταράσσει σηματοδοτικά μονοπάτια που ρυθμίζουν τόσο την κυτταρική πολικότητα και την κυτταρική κίνηση, όσο τον πολλαπλασιασμό καιτην απόπτωση. Μερικές από αυτές τις αλληλεπιδράσεις εξαρτώνται και ρυθμίζονται από την φωσφορυλίωση της πρωτεΐνης στο καρβοξυτελικό της άκρο και άλλες είναι ανεξάρτητες αυτής. Βασικό χαρακτηριστικό της λοίμωξης από H. pylori αποτελεί η διήθηση στο γαστρικό χόριο ουδετεροφίλων πολυμορφοπύρηνων κυττάρων. Κύριος χημειοτακτικός παράγοντας των ουδετεροφίλων είναι η Ιντερλευκίνη 8 (IL-8). Ο μοριακός μηχανισμός μέσω του οποίου το H. pyloriεπάγει την αύξηση έκκρισης της IL-8 παραμένει ένα ευρύ πεδίο διαφωνίας στην βιβλιογραφία. Αρχικά,υποστηρίχθηκε ότι εξαρτάται από την παρουσία ενός λειτουργικού συστήματος μεταφοράς τύπου ΙVτου βακτηρίου, ανεξαρτήτως της δράσης της πρωτεΐνης CagA, μετέπειτα όμως απεδείχθη ότι η CagAμπορεί να συμβάλλει καθοριστικά στην έκταση της επαγωγής. Επιπλέον, άλλοι εκκρινόμενοι παράγοντες παθογένειας του βακτηρίου, εκτός του συστήματος μεταφοράς τύπου ΙV και της CagA,προτάθηκαν να συνεισφέρουν στην επαγωγή Ιντερλευκίνης-8 και επομένως στην ανάπτυξη της χρόνιας ενεργού γαστρικής φλεγμονής.Σκοπός της παρούσας διατριβής ήταν η μελέτη της εμπλοκής της πρωτεΐνης CagA στους μηχανισμούς επαγωγής της γαστρικής φλεγμονής και διεξήχθη σε δύο στάδια, το πρώτο επιδημιολογικό και το δεύτερο με χρήση συστημάτων πειραματικής λοίμωξης H. pylori. Στο πρώτο στάδιο, έγινε επιδημιολογική ανάλυση κλινικών στελεχών συμπτωματικών ασθενών από την Καμπότζη, όπου απεδείχθη συσχέτιση μεταξύ των πολυμορφικών χαρακτηριστικών των κύριων παραγόντων παθογένειας CagA και VacA με την βαρύτητα της κλινικής έκβασης της νόσου.Μάλιστα διαπιστώθηκε διείσδυση στελεχών με πολυμορφικά χαρακτηριστικά Δυτικού τύπου,δικαιολογώντας με αυτό τον τρόπο μερικώς, τα μειωμένα επίπεδα εμφάνισης γαστρικού καρκίνου που παρατηρούνται σε αυτή τη χώρα, σε σύγκριση με τα υψηλότερα επίπεδα, όμορων χωρών. Η μελέτη αυτή αποτέλεσε συνέχεια άλλων παρόμοιων μελετών που πραγματοποιήθηκαν στον Ελληνικό πληθυσμό (Panayotopoulou Ε. και συν. 2007, Sgouras D. και συν. 2009, Panayotopoulou Ε. και συν.2010 ), των οποίων τα αποτελέσματα δεν αποτελούν μέρος της παρούσας διατριβής, έγιναν όμως και με την συνδρομή του συγγραφέα της παρούσας διατριβής.Στο δεύτερο στάδιο, μελετήθηκε η επίπτωση των επαναλαμβανόμενων θέσεων φωσφορυλίωσης EPIYA της πρωτεΐνης CagA του H. pylori στο μοριακό μηχανισμό επαγωγής της Ιντερλευκίνης-8 και επομένως στην ανάπτυξη της χρόνιας ενεργού γαστρικής φλεγμονής με συστήματα πειραματικής λοίμωξης H. pylori. Για το σκοπό αυτό κατασκευάστηκαν μεταλλαγμένα στελέχη που εξέφραζαν τηνπρωτεΐνη CagA με μεταβλητό αριθμό λειτουργικών θέσεων φωσφορυλίωσης EPIYA-C, και των αντίστοιχων μη-φωσφορυλιώσιμων EPIFA, στο ίδιο ισογονιδιακό γενετικό υπόβαθρο. Στην συνέχεια τα παραπάνω παραχθέντα στελέχη χρησιμοποιήθηκαν για να μολύνουν γαστρικές επιθηλιακές κυτταρικές σειρές. Παρατηρήθηκε, ότι η μεταγραφική ενεργοποίηση του γονιδίου της IL-8 αλλά και τα επίπεδα της εκκρινόμενης IL-8 ήταν αυστηρά εξαρτώμενα από την λειτουργικότητα των μοτίβων φωσφορυλίωσης EPIYA-C. Επιπλέον, τα επίπεδα της IL-8 και η ενεργοποίηση του γονιδίου της IL-8 ήταν η ίδια, ανεξάρτητα από τον αριθμό των επαναλήψεων EPIYA-C και μέσω ενεργοποίησης του συστήματος NF-kB. Επιπλέον, καταδείχθηκε ότι όσον αφορά τις σηματοδοτικές οδούς που οδηγούν στην ενεργοποίηση του NF-kB, η πρώιμη ERK1/2 και ΑΚΤ ενεργοποίηση, βρέθηκε να είναι ανεξάρτητη από την EPIYA-C φωσφορυλίωση. Αντιθέτως, η αναστολή της TAK1 κινάσης, είτε χημικά με χρήση του ειδικού αναστολέα 5Ζ-7-Oxozeaenol, είτε γενετικά, με χρήση TAK1-/- εμβρυϊκών ινοβλαστών ποντικού (MEFs) στα εν λόγω συστήματα πειραματικής λοίμωξης H. pylori, οδήγησε σε πλήρη αναστολή ενεργοποίησης του ΝF-κΒ και επομένως της έκκρισης της IL-8, με έναν δόσο-εξαρτώμενο τρόπο, ανεξάρτητα από την παρουσία της CagA. Τέλος διαπιστώθηκε ότι η CagA και ηTAK1 συμμετέχουν στο ίδιο σύμπλοκο ενεργοποίησης μια και βρέθηκαν να ανοσοκαταβυθίζονται μαζί και ότι αυτή η αλληλεπίδραση δεν γινόταν μέσω των περιοχών της πρωτεΐνης που περιείχαν τις επαναλαμβανόμενες θέσεις φωσφορυλίωσης EPIYA.