Συμβολή λοιμοτοξικών παραγόντων του ελικοβακτηριδίου του πυλωρού στην ενεργοποίηση παραγόντων που ρυθμίζουν τη δομή της εξωκυττάριας ύλης

Abstract

As a result of H. pylori adhesion to gastric epithelial cells the bacterial effector CagA is translocated intracellularly and, following its hierarchic tyrosine phosphorylation on multiple EPIYA motifs, deregulates cellular polarity and contributes to the induction of an elongation and scattering phenotype resembling epithelial to mesenchymal transition (EMT). Stromelysin-1/matrix metalloproteinase-3 (MMP-3) has been reported to induce a sequence of molecular alterations leading to stable EMT conversion and carcinogenesis in epithelial cells. To identify the putative role of CagA protein in MMP-3 induction we exploited an experimental H. pylori infection system in gastric epithelial cell lines. We utilized isogenic mutants expressing CagA protein with variable numbers of terminal EPIYA and phosphorylation-deficient EPIFA motifs, as well as the cagA-KO and translocation-deficient cagE-KO strains. Increased levels of MMP-3 transcriptional activation was determined by RTqPCR, in the case of strains bearing more than 2 terminal EPIYA phosphorylation motifs in CagA. MMP-3 expression in total cell lysates and the corresponding culture supernatants was associated to CagA expression, translocation and was dependent on CagA phosphorylation. CagA-EPIYA phosphorylation-dependent increase in gelatinase and caseinolytic activity was also detected in culture supernatants, utilizing zymography. Significant increase in transcriptional activity of mesenchymal markers vimentin, Snail and ZEB1 and stem cell marker CD44, was observed only in the case of EPIYA phosphorylation-functional CagA. CagA EPIYA phosphorylationdependent increase in the transcriptional activation of MMP-9, another EMT marker, was also observed. Our data suggest that CagA protein can induce EMT through its successful intracellular translocation and subsequent phosphorylation, by a mechanism which also involves MMP-3, as well as, key mesenchymal and stemness markers Vimentin, Snail, ZEB1, and CD44.

Μετά τη προσκόλληση του Helicobacter pylori (H. pylori) στα γαστρικά επιθηλιακά κύτταρα, η πρωτεΐνη CagA μεταφέρεται ενδοκυτταρικά στα γαστρικά επιθηλιακά κύτταρα και ακολουθεί η διαδοχική της φωσφορυλίωση σε κατάλοιπα τυροσίνης πολλαπλών μοτίβων EPIYA. Η φωσφορυλίωση των μοτίβων συντελεί στην απορρύθμιση της κυτταρικής πολικότητας των επιθηλιακών κυττάρων, καθώς και στην απόκτηση ενός φαινότυπου διασποράς και επιμήκυνσης, ο οποίος προσομοιάζει στην επιθηλιακή προς μεσεγχυματική μετατροπή (EMT). Η στρωμελυσίνη-1/ιστική μεταλλοπρωτεϊνάση-3 (MMP-3) έχει δειχθεί ότι επάγει μια ακολουθία μοριακών μεταβολών οι οποίες οδηγούν στην EMT και στη καρκινογένεση των επιθηλιακών κυττάρων. Για να προσδιορίσουμε το ρόλο της πρωτεΐνης CagA κατά την επαγωγή της MMP-3 χρησιμοποιήσαμε ένα πειραματικό σύστημα, όπου μολύνθηκαν γαστρικές επιθηλιακές σειρές με ποικίλα στελέχη του H. pylori. Πιο συγκεκριμένα, χρησιμοποιήσαμε ισογενή μεταλλαγμένα στελέχη, τα οποία εξέφραζαν τη πρωτεΐνη CagA με μεταβαλόμενο αριθμό λειτουργικών θέσεων φωσφορυλίωσης EPIYA, καθώς επίσης και τα αντίστοιχα μη λειτουργικά στελέχη όσον αφορά την φωσφορυλίωση, με αντικατάσταση της τυροσίνης με φαινυλαλανίνη (EPIFA). Επιπλέον χρησιμοποιήθηκαν στελέχη που δεν εξέφραζαν τη πρωτεΐνη CagA (cagA-KO),καθώς και στελέχη που δε μπορούσαν να τη μεταφέρουν εντός των κυττάρων, λόγω δυσλειτουργίας του εκκριτικού συστήματος μεταφοράς τύπου-4 (cagEKO). Παρατηρήθηκε, με χρήση της μεθόδου RT-qPCR, αύξηση στη μεταγραφική ενεργοποίηση της MMP-3, στα κύτταρα που είχαν μολυνθεί με στελέχη που διέθεταν περισσότερες από δύο λειτουργικές θέσεις φωσφορυλίωσης EPIYA στη πρωτεΐνη CagA. Κατ’ αναλογία, η έκφραση της MMP-3 σε ολικά κυτταρολύματα και στα αντίστοιχα υπερκείμενα κυτταροκαλλιεργειών συσχετίσθηκε με την έκφραση της πρωτεΐνης CagA, καθώς και την ενδοκυττάρια ενσωμάτωση και φωσφορυλίωση της. Παρατηρήθηκε επίσης αυξημένη καζεϊνολυτική και ζελατινολυτική δραστηριότητα στα υπερκείμενα των κυττάρων, με χρήση ενζυμογραφίας, η οποία φάνηκε να εξαρτάται από τη φωσφορυλίωση της CagA στις θέσεις φωσφορυλίωσης EPIYA. Σημαντική αύξηση παρατηρήθηκε, επίσης, στη μεταγραφική ενεργοποίηση των μεσεγχυματικών δεικτών βιμεντίνη, Snai1 και ZEB1, καθώς επίσης και του δείκτη βλαστικότητας CD44, μόνο στη περίπτωση όπου τα κύτταρα είχαν μολυνθεί με CagA-θετικά στελέχη με λειτουργικές θέσεις φωσφορυλίωσης EPIYA. Τέλος, παρατηρήθηκε σημαντική αύξηση στη μεταγραφική ενεργοποίηση της MMP-9, η οποία έχει δειχθεί ότι συμμετέχει στη διαδικασία ΕΜΤ και αποδείχθηκε ότι εξαρτάται από τη φωσφορυλίωση της πρωτεΐνης CagA στις θέσεις φωσφορυλίωσης EPIYA. Τα αποτελέσματα μας καταδεικνύουν ότι η πρωτεΐνη CagA ενέχεται στη διαδικασία επαγωγής της ΕΜΤ, μέσω της επαγωγής έκφρασης MMP-3, αλλά και κομβικών μεσεγχυματικών δεικτών της EMT, με μηχανισμό που φαίνεται να εξαρτάται από την ενδοκυτταρική μεταφορά της πρωτεΐνης CagA εντός των γαστρικών επιθηλιακών κυττάρων και την ενδοκυτταρική φωσφορυλίωση της CagA στις λειτουργικές θέσεις EPIYA.