Μελέτη και αξιολόγηση μικροφυκών ως πηγή προϊόντων υψηλής προστιθέμενης αξίας

Abstract

Microalgae are an extremely heterogeneous group of organisms. This genetic diversity makes microalgae, a rich source of biomolecules with applications in the feed, food, nutritional, cosmetic, pharmaceutical and even fuel industries. The purpose of the present study was the evaluation of selected Chlorella, Nannochloropsis, Tetraselmis and Phaeodactylum strains as a source of high value added products.In the first part of the work, aqueous extracts from eight Chlorella strains were evaluated towards selected cosmeceutical properties such as enzymatic and non-enzymatic antioxidant capacity, glutathione content and inhibition potency towards skin regulatory enzymes (tyrosinase and elastase). Total antioxidant capacity (TAC) measurements, determined by a series of non-enzymatic assays (FRAP, ABTS, DPPH), showed significant variabilities among strains suggesting a large chemical diversity of antioxidants in Chlorella species. The second part of the work provides the characterization of the chemical and enzymatic content of three species Nannochloropsis, Phaeodactylum and Tetraselmis, grown under different conditions (high temperature, 5 ‰ salinity and low levels of nitrogen). The results showed that the different culture conditions affect the expression of antioxidant enzymes, proteases and lipasesUnderstanding the genetic and molecular basis of the detoxifying mechanism in Chlamydomonas reinhardtii is an important goal towards the development of bioremediation tools for contaminated environments. A genome survey of C. reinhardtii revealed the presence of fifteen GST-like isoenzymes (CrGSTs). Comparison by multiple sequence alignment generated a dendrogram, revealing the phylogenetic relationships of CrGSTs with other well-characterized GST classes. Notably, we identified sequences that are most closely related to the sigma class enzymes which so far have only been found in animals. Two sigma class related isoenzymes (CrGST10 and CrGST7) were cloned, expressed in E. coli and their substrate specificity and kinetic properties were determined towards a range of different xenobiotic substrates. The structural and kinetic features of the enzymes were studied by molecular modelling and site-directed mutagenesis. The catalytic role of active-site residue Tyr7 and the roles of Trp99 in determining substrate specificity and thermostability were investigated. In the next part, the functional and catalytic properties of the isoenzyme CrGST8 was investigated. CrGST8 belong to the Theta class of GSTs and noticeable lacks the C-terminal helix. CrGST8 was cloned and expressed in E. coli. SDS/PAGE analysis of crude lysates and cell debris showed that the enzyme is overexpression in the form of inclusion bodies. The effect of temperature and IPTG concentration on CrGST8 expression was evaluated. Different chaotropic agents (urea and/or guanidium chloride) and buffer conditions were assessed towards solubilisation and refolding of CrGST8. The results showed that high concentration of urea and Tris buffer containing arginine and GSH provides the appropriate condition for solubilization and refolding of the enzyme. The enzyme was characterized by kinetic analysis, pH evaluation and heat inactivation.

Σκοπός της παρούσας διατριβής ήταν η μελέτη των ακατέργαστων υδατικών εκχυλισμάτων από μικροφύκη Chlorella sp., Nannochloropsis sp., Tetraselmis sp. και Phaeodactylum sp.. Μια τέτοια μελέτη στοχεύει στην ανάγκη εύρεσης νέων πράσινων πηγών, πλούσιων σε αντιοξειδωτικές ουσίες, ώστε να χρησιμοποιηθούν ως πρώτες ύλες στη βιομηχανία τροφίμων και καλλυντικών. Επιπρόσθετα, μελετήθηκαν ένζυμα GSTs από το γένος Chlamydomonas με στόχο την απόκτηση περαιτέρω γνώσεων που σχετίζονται με GSTs από θαλάσσιους οργανισμούς.Με στόχο την κατανόηση του ρόλου των GSTs στους φωτοσυνθετικούς οργανισμούς αλλά και την εύρεση στοιχείων για την ανάπτυξη νέων βιοτεχνολογικών εφαρμογών, ακολούθησε η μελέτη του γονιδιώματος Chlamidomonas reinhardtii. Τα αποτελέσματα φανέρωσαν την παρουσία 15 GST-like ενζύμων (CrGSTs) τα οποία αναλύθηκαν φυλογενετικά. Τα ισοένζυμα CrGST10 και CrGST7, που φαίνεται να ανήκουν στη Sigma τάξη, κλωνοποιήθηκαν, εκφράστηκαν σε βακτηριακά κύτταρα E. coli και προσδιορίστηκε η εκλεκτικότητά τους έναντι ηλεκτρονιόφιλων υποστρωμάτων. Ακολούθησε μελέτη της δομής και της κινητικής συμπεριφοράς με μοριακή μοντελοποίηση και κατευθυνόμενη μεταλλαξογέννεση. Συγκεκριμένα, επιβεβαιώθηκε ο καταλυτικός ρόλος του αμινοξέος Tyr7 ενώ διερευνήθηκε ο ρόλος του αμινοξέος Trp99 στον προσδιορισμό εξειδίκευσης ηηλεκτρονιόφιλων υποστρωμάτων, στην επίδραση του pH και στη θερμοσταθερότητα.Η διατριβή ολοκληρώθηκε με την απομόνωση του ενζύμου CrGST8 από cDNA βιβλιοθήκηChlamidomonas, το οποίο φαίνεται να ανήκει στην τάξη Theta. Η υπερέκφραση του ενζύμου CrGST8 οδήγησε σε ενδοκυτταρική συσσώρευση μερικώς αναδιπλωμένων πρωτεϊνών (έγκλειστα σωμάτια). Ακολούθησαν δοκιμές βελτιστοποίησης των συνθηκών έκφρασης με χρήση διαφορετικής συγκέντρωσης IPTG και θερμοκρασίας. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι οι συγκεκριμένοι παράγοντες δεν επηρεάζουν στη δημιουργία των συσσωματωμάτων. Στη συνέχεια έγινε χρήση χαοτροπικών ουσιών όπως η ουρία και το χλωρίδιο του γουανιδίου. Με σκοπό τον έλεγχο της επίδρασης μιας ηπιότερης μεθόδου αναδίπλωσης, έγινε δοκιμή διαλυτοποίησης του ενζύμου με χρήση προπανόλης. Θετικά αποτελέσματα παρουσίασαν μόνο οι χαοτροπικές ουσίες και κυρίως η ουρία. Έπειτα πραγματοποιήθηκε μελέτη της εκλεκτικότητας του ενζύμου έναντι διαφορετικών υποστρωμάτων. Η επίδραση του pH στην ενζυμική δραστικότητα του CrGST8 έδειξε ότι εμφανίζει προτίμηση στην όξινη περιοχή των pH με μέγιστη τιμή στο pH 5,6, ενώ σε pH 7 η ενζυμική δραστικότητα έχει σχεδόν μηδενιστεί.Συνοψίζοντας, τα μικροφύκη έχουν κεντρίσει την προσοχή του βιομηχανικού τομέα, με την εφαρμογή τους να απαντάται σε ποικιλία προϊόντων όπως σε τρόφιμα, φάρμακα και καλλυντικά. Η χρήση αντιοξειδωτικών από φυσικές και πράσινες πηγές όπως τα μικροφύκη αντιπροσωπεύει έναν τομέα που κερδίζει μεγάλο ενδιαφέρον στη διάρκεια του χρόνου με ευρύ φάσμα βιοτεχνολογικών εφαρμογών. Τα ευρήματά μας υπογραμμίζουν ότι τα εκχυλίσματα των ειδών Chlorella και κυρίως του στελέχους Chlorella minutissima, αντιπροσωπεύουν πολλά υποσχόμενα βιοδραστικά συστατικά με δυνατότητα χρήσης τους ως πρώτες ύλες. Tέλος, ο χαρακτηρισμός των ενζύμων CrGST10, CrGST7 και CrGST8 από το στέλεχος Chlamydomonas reinhardtii και η φυλογενετική ανάλυση έδωσαν πληροφορίες σχετικά με την εξέλιξη της οικογένειας των GSTs και το μηχανισμό δέσμευσης του υποστρώματος και εξειδίκευσης.