Μελέτη των μηχανισμών καρδιοπροστασίας στο μυοκάρδιο με έλλειψη δεσμίνης

Abstract

The muscle specific intermediate filament protein, desmin, and the small heat shock protein, αB-crystallin interact with each other, and they play important roles in cardioprotection. Mutations in both proteins in humans and mice lead to cardiomyopathy and heart failure with common pathological characteristics and profound mitochondrial abnormalities, suggesting an important functional interplay between them in cardioprotection. To address the role of desmin and αB-crystallin, and their potential interplay in mitochondrial homeostasis and cardioprotection, we investigated the consequences of cardiac specific αΒ-crystallin overexpression in the desmin deficient (des-/-) cardiomyopathy model. The des-/- model possesses a combination of the pathology of most types of cardiomyopathy, with structural abnormalities and apparent mitochondrial defects, leading to cell death, inflammation and fibrosis, ultimately resulting in cardiomyopathy and heart failure. αΒ-crystallin overexpression in the des-/- myocardium halts completely heart failure development while improves remarkably the heart defects due to lack of desmin. Cardiac function is significantly improved, reaching almost the wild type (wt) levels. This improvement is more profound by the 100% survival rate of des-/- mice overexpressing αΒ-crystallin (des-/-αBCry) in an obligatory swimming protocol during which only 50% of the des-/- mice survive. In an effort to further investigate the improvement of des-/-hearts by αB-crystallin overexpression, we examined myocardial ultrastructure by electron microscopy. The ultrastructural defects of the des-/- myocardium such as myofibril perturbations and mitochondrial abnormalities, including mitochondrial swelling, altered shape and positioning and excessive cristae destruction, are extensively corrected. Also, αΒ-crystallin overexpression provides significant protection against increased levels of ROS found in des-/- adult cardiomyocytes, consistent with the recovery of the reduced glutathione availability. Moreover, we found that mitoprotection by αΒ-crystallin overexpression takes place through inhibition of abnormal activation of the mitochondrial permeability transition pore (mPTP) and dissipation of mitochondrial membrane potential (Δψm) in the absence of desmin. To further investigate the mechanism of mitoprotection, we performed comparative proteomic analysis in isolated mitochondria from wt, des-/- and des-/-αBCry mice. Desmin deficiency leads to diminished levels of many enzymes involved in aerobic respiration and important mitochondrial proteins, like mitofilin/Mic60. αΒ-crystallin overexpression restores the levels of the altered proteins close to wild type levels. In an effort to understand the underlying mechanisms responsible for the observed mitochondrial defects in the absence of desmin desmin and the extensive protection by αΒ-crystallin overexpression, we found that both desmin and αΒ-crystallin, interact with proteins important for mitochondrial inner membrane morphology and function, such as mitofilin, OPA1 (optic atrophy 1) and ATP synthase. Moreover, we found that among other sites, both desmin and αΒ-crystallin localize at MAMs (sarcoplasmic reticulum (SR) - mitochondria associated membranes), where they interact with VDAC (voltage depedent anion channel) and MICOS complex (contact site and cristae organizing system). The above interactions suggest an important functional role for both desmin and αΒ-crystallin in maintaining mitochondrial homeostasis and bioenergetics and preventing cell death. In conclusion, αΒ-crystallin could be an exceptional therapeutic for cardiomyopathy, since it halts completely heart failure development in the desmin deficiency model and improves significantly its defects. Desmin and αΒ-crystallin functions in the mitochondria-SR interface enable the fine tuning of the cardiomyocytes and their ability to meet the energetic demands of the muscle. The results of this thesis open new avenues of investigations for cardioprotection and the contribution of intermediate filaments in organelles cross-talk, function and homeostasis.

Το μυοειδικό ενδιάμεσο ινίδιο, δεσμίνη, αλληλοεπιδρά με τη μικρή θερμοεπαγόμενη πρωτεΐνη, αΒ-κρυσταλλίνη και η συμμετοχή τους στην καρδιοπροστασία έχει δειχθεί σε διάφορες μελέτες, χωρίς, όμως, ο ρόλος τους να έχει διευκρινιστεί πλήρως. Μεταλλάξεις και στις δύο πρωτεΐνες οδηγούν σε μυοκαρδιοπάθειες και καρδιακή ανεπάρκεια σε ανθρώπους και μύες, με κοινά παθολογικά χαρακτηριστικά και εκτεταμένα μιτοχονδριακά προβλήματα, οδηγώντας στην υπόθεση ότι υπάρχει λειτουργική αλληλεπίδραση μεταξύ τους στην καρδιοπροστασία. Για να διαλευκάνουμε το ρόλο της δεσμίνης και της αΒ-κρυσταλλίνης στη μιτοχονδριακή ομοιόσταση και καρδιοπροστασία, υπερεκφράσαμε ειδικά στην καρδιά την αΒ-κρυσταλλίνη στο μοντέλο μυοκαρδιοπάθειας του μυός με έλλειψη δεσμίνης (des-/-). Το des-/- μοντέλο παρουσιάζει ένα συνδυασμό της παθολογίας των περισσοτέρων τύπων μυοκαρδιοπαθειών, με δομικές ανωμαλίες και εμφανή μιτοχονδριακά προβλήματα, τα οποία οδηγούν σε κυτταρικό θάνατο, φλεγμονή και ίνωση, καταλήγοντας σε ανάπτυξη μυοκαρδιοπάθειας και καρδιακή ανεπάρκεια. Οι μελέτες μας έδειξαν ότι η υπερέκφραση της αΒ-κρυσταλλίνης εμποδίζει την ανάπτυξη μυοκαρδιοπάθειας και βελτιώνει σημαντικά όλα τα παθολογικά χαρακτηριστικά της καρδιάς με έλλειψη δεσμίνης. Η καρδιακή λειτουργία βελτιώνεται εξαιρετικά, φθάνοντας σχεδόν τα επίπεδα του αγρίου τύπου. Αυτή η βελτίωση εξακριβώνεται και υπό συνθήκες στρες, καθώς des-/- μύες που υπερεκφράζουν αΒ-κρυσταλλίνη επιβιώνουν σε ποσοστό 100% σε ένα πρωτόκολλο εξαναγκαστικής άσκησης, κατά το οποίο μόλις 50% των des-/- μυών επιβιώνει. Η εξέταση της υπερδομής του des-/- μυοκαρδίου με ηλεκτρονική μικροσκοπία έδειξε ότι τα δομικά ελαττώματα της des-/- καρδιάς, όπως η διαταραγμένη διάταξη των μυοϊνιδίων και οι μιτοχονδριακές ανωμαλίες, συμπεριλαμβάνοντας το μιτοχονδριακό οίδημα, τις αλλοιώσεις της θέσης και του σχήματος και την εκτεταμένη καταστροφή των πτυχώσεων (cristae), έχουν διορθωθεί σε μεγάλο βαθμό. Επίσης, η υπερέκφραση της αΒ-κρυσταλλίνης παρέχει αντιοξειδωτική προστασία στα des-/- μυοκαρδιοκύτταρα, μειώνοντας τα αυξημένα επίπεδα ενεργών ριζών οξυγόνου, τουλάχιστον μέσω της αύξησης της διαθεσιμότητας της γλουταθειόνης. Επιπλέον, βρήκαμε ότι η εκτεταμένη προστασία των μιτοχονδρίων από την υπερέκφραση της αΒ-κρυσταλλίνης περιλαμβάνει την αναστολή της μη φυσιολογικής διάνοιξης του πόρου μετάπτωσης της μιτοχονδριακής διαπερατότητας (mPTP; mitochondrial permeability transition pore) και της μείωσης του μιτοχονδριακού μεμβρανικού δυναμικού (Δψm) που συμβαίνουν κατά την απουσία δεσμίνης. Για να διερευνήσουμε περαιτέρω το μηχανισμό της μιτοχονδριακής προστασίας, πραγματοποιήσαμε συγκριτική πρωτεομική ανάλυση των μιτοχονδρίων από καρδιές μυών άγριου τύπου (wt), des-/- και des-/- που υπερεκφράζουν αΒ-κρυσταλλίνη (des-/-αBCry). Η απουσία δεσμίνης οδηγεί σε μείωση των πρωτεϊνικών επιπέδων πολλών ενζύμων του αερόβιου μεταβολισμού και σημαντικών μιτοχονδριακών πρωτεϊνών, όπως η μιτοφιλίνη (mitofilin/ Mic60). Η υπερέκφραση αΒ-κρυσταλλίνης επαναφέρει τα αλλαγμένα επίπεδα των ενζύμων κοντά στα φυσιολογικά. Ερευνώντας τον υπεύθυνο μηχανισμό αυτών των αλλαγών, βρήκαμε ότι η δεσμίνη και η αΒ-κρυσταλλίνη, αλληλεπιδρούν με πρωτεΐνες που παίζουν σημαντικό ρόλο στη μορφολογία των πτυχώσεων της εσωτερικής μεμβράνης των μιτοχονδρίων και τη λειτουργία των μιτοχονδρίων, όπως η μιτοφιλίνη, η OPA1 (optic atrophy 1) και η ΑΤΡ συνθετάση. Ακόμη, βρήκαμε ότι η δεσμίνη και η αΒ-κρυσταλλίνη, επιπλέον των γνωστών σημείων, εντοπίζονται σε εξειδικευμένες μεμβράνες του σαρκοπλασματικού δικτύου οι οποίες συνδέονται με τα μιτοχόνδρια (MAMs: mitochondria associated membranes), όπου αλληλεπιδρούν με τη VDAC (voltage depedent anion channel) και το σύμπλοκο MICOS (mitochondrial contact site and cristae organizing system), γνωστό για το σημαντικό του ρόλο στη μορφολογία και λειτουργία των μιτοχονδρίων. Οι παραπάνω αλληλεπιδράσεις προβάλλουν ένα σημαντικό ρόλο για τη δεσμίνη και την αΒ-κρυσταλλίνη στη διατήρηση της μιτοχονδριακής ομοιόστασης, στην αναστολή του κυτταρικού θανάτου και στη βιοενεργητική του κυττάρου.Συμπερασματικά, η αΒ-κρυσταλλίνη αποτελεί ένα εξαιρετικό θεραπευτικό μέσον για τη μυοκαρδιοπάθεια, καθώς αναστέλλει πλήρως την ανάπτυξή της στο μοντέλο του μυός με έλλειψη δεσμίνης, βελτιώνοντας σημαντικά όλα τα παθολογικά χαρακτηριστικά. Η δράση της δεσμίνης και της αΒ-κρυσταλλίνης στον άξονα μιτοχονδρίων-σαρκοπλασματικού δικτύου δίνει την ικανότητα στο μυοκαρδιοκύτταρο να συντονίσει τις λειτουργίες του και να ανταπεξέρχεται στις αυξημένες ενεργειακές ανάγκες του μυός. Τα αποτελέσματα της παρούσας διδακτορικής διατριβής ανοίγουν νέους ορίζοντες για έρευνα σχετικά με την καρδιοπροστασία και τη συμβολή των ενδιάμεσων ινιδίων στην αλληλεπίδραση και ομοιόσταση των οργανιδίων.