Επίδραση των μεθόδων παρασκευής ιστοτεχνολογικών βιοϋλικών μεγάλης παραμορφωσιμότητας στις μηχανικές τους ιδιότητες και τη βιοσυμβατότητά τους

Abstract

In TE scaffolding, the ability of scaffolds to preserve proper mechanical and biological function and compatibility with the surrounding tissues and organs, as well to enhance host cells to adhere with scaffold material in their surface and 3D structure is of paramount importance for potential regenerative cell response in vivo.The aim of the present thesis is to produce and characterise a decellularized extracellular matrix derived from animal soft tissues, scoping to a scaffold capable of exhibiting the mechanical and biological properties desired for tissue engineering (TE) applications.For this work bovine pericardial tissue was selected, due to its broad use as a biomaterial in different implant technologies for decades. Two different protocols for the decellularization of bovine pericardial tissue were developed incorporating Triton® X–100, SDS and deoxycholic acid (12 h, 4°C) in solution 1 (Triton) and trypsin/EDTA with RNAse/DNase at 37°C for 48 h in solution 2 (Trypsin). Histological analysis confirmed total absence of cells after both treatments.The results of the biomechanical tests showed no mechanical differences demonstrated between the fresh and decellularized pericardial tissues by Triton solution in both, apex to base and transverse anatomical directions, contrary to a significant decrease of the low elastic modulus (elastin phase) and high elastic modulus (collagen phase) demonstrated after trypsin solution treatment in both directions.Biochemical analysis verified the direct relationship between mechanical viscoelastic properties of soft tissues with the constituent tissue components (GAGs and collagen content) and their internal arrangement. The comparison of the results from untreated and that from treated tissues suggested that the Triton decellularization method seemed to be a very mild treatment, as the glycozaminoglycans (GAGs) composition remained constant, as well as the collagen content. This was not achieved with the decellularization using Trypsin, where a significant reduction of GAGs, both chondroitin/dermatan sulphate and hyaluronan, was found.Aortic bovine endothelial cell seeding was used for estimation of its biomaterials’ cytocompatibility. Endothelialization achieved after 24hrs to 4 days periods. The adhesion strength of cells, cultured for 4 days on decellularized bovine pericardial tissues, was also determined. By applying a radially increasing shear stress field on rotating material samples within a stationary fluid mesh using a spinning disc device, we determined the shear stress necessary to detach the cells from the sfafolds’ surface. Fine cell spreading and proliferation on biomaterials’ surface and good surface cell density (>60%) at physiological shear stress scale were observed and measured.In conclusion, decellularization of bovine pericardial tissues under long time duration in 37°C (Trypsin) seems to alter its biomechanical behaviour and structural integrity, which, in contrast, was retained under low temperature short duration treatment (Triton). Additionally, both protocols resulted in a cytocompatible biomaterial, regarding its surface interactions with endothelial cells.

Στην ιστοτεχνολογία (tissue engineering – TE), η ικανότητα των ικριωμάτων (scaffolds) να διατηρούν συμβατή μηχανική και βιολογική συμπεριφορά με τους περιβάλλοντες ιστούς και όργανα, αλλά και να διευκολύνουν την προσκόλληση κυττάρων του ξενιστή στην επιφάνεια και την τρισδιάστατη δομή τους κρίνεται ως υψίστης σημασίας για την επιθυμητή εκδήλωση αναγεννητικής αντίδρασης των κυττάρων in vivo.Ο σκοπός της παρούσας διδακτορικής διατριβής είναι η δημιουργία και ο χαρακτηρισμός ακυτταροποιημένης εξωκυττάριας μήτρας από μαλακούς ιστούς ζωικής προέλευσης, με στόχο τη δημιουργία ικριώματος με επιθυμητές μηχανικές και βιολογικές ιδιότητες για εφαρμογές στην ιστοτεχνολογία.Στην εργασία αυτή επιλέχθηκε ως υλικό της μελέτης ο βόειος περικαρδιακός ιστός, λόγω της ευρείας πολύχρονης χρήσης του ως βιοϋλικό σε μοσχεύματα. Εφαρμόστηκαν δύο διαφορετικά πρωτόκολλα για την ακυτταροποίηση του ιστού, χρησιμοποιώντας στο πρώτο Triton Χ-100, SDS και deoxycholic acid (12 ώρες, 4°C - Triton) και στο δεύτερο Trypsin/EDTA με RNAse/DNAse (48 ώρες, 37°C – Trypsin). Η ιστολογική εξέταση επιβεβαίωσε την ολική αφαίρεση των κυττάρων.Τα αποτελέσματα των εμβιομηχανικών δοκιμών δεν έδειξαν στατιστικά σημαντική διαφορά μεταξύ των μηχανικών ιδιοτήτων των μη κατεργασμένων ιστών και των ακυτταροποιημένων περικαρδιακών ιστών με Triton στην οριζόντια και κάθετη διεύθυνση προς τον οβελιαίο άξονα της καρδιάς σε αντίθεση με τη μείωση του χαμηλού μέτρου ελαστικότητας (φάση ελαστίνης) και του υψηλού μέτρου ελαστικότητας (φάση κολλαγόνου) μετά την κατεργασία των υλικών με Trypsin, και στις δύο κατευθύνσεις.Η βιοχημική ανάλυση επαλήθευσε την άμεση σχέση μεταξύ των μηχανικών βισκοελαστικών ιδιοτήτων των μαλακών ιστών με τα συστατικά (GAGs και κολλαγόνο) του ιστού και την εσωτερική διαμόρφωση τους. Τα αποτελέσματα των μη επεξεργασμένων και των επεξεργασμένων ιστών με τα παραπάνω διαλύματα, έδειξαν ότι το διάλυμα του Triton προκαλεί ήπια κατεργασία, με ελαχιστοποίηση των δομικών μεταβολών της εξωκυττάριας μήτρας, όπως η σταθερή σύσταση των γλυκοζαμινογλυκανών (GAGs) και η περιεκτικότητα των ιστών σε κολλαγόνο. Αυτό δεν επιτεύχθηκε με την χρήση διαλύματος Trypsin , όπου παρατηρήθηκε σημαντική μείωση των GAGs, τόσο στη συγκέντρωση της θειϊκής χονδροϊτίνης / δερματάνης όσο και στο υαλουρονικό.Για την αξιολόγηση της κυτταροσυμβατότητας αορτικά βόεια ενδοθηλιακά κύτταρα καλλιεργήθηκαν στα ακυτταροποιημένα υλικά. Η επιθηλιοποίησή τους επετεύχθη από 24 ώρες μέχρι και 4 μέρες. Προσδιορίστηκε επίσης η δύναμη προσκόλλησης των κυττάρων μετά από 4 μέρες καλλιέργειας στους ακυτταροποιημένους περικαρδιακούς ιστούς με την εφαρμογή διατμητικών τάσεων μέσω ροϊκού πεδίου, με χρήση κατάλληλης μηχανής περιστροφής των δειγμάτων σε ακινητοποιημένο υγρό. Τα αποτελέσματα έδειξαν εξάπλωση και πολλαπλασιασμό των κυττάρων στην επιφάνεια των βιοϋλικών, ενώ παρατηρήθηκε καλή συγκέντρωση κυττάρων (> 60%) στην κλίμακα των φυσιολογικών διατμητικών τάσεων.Συμπερασματικά, η ακυτταροποίηση του βόειου περικαρδιακού ιστού για μεγάλη χρονική διάρκεια στους 37°C (Trypsin) φάνηκε να μεταβάλλει την εμβιομηχανική συμπεριφορά και τη δομική ακεραιότητα του ιστού, η οποία, αντίθετα, διατηρείται σε φυσιολογική κατάσταση μετά από κατεργασία σε χαμηλή θερμοκρασία και σε σύντομο χρόνο (Triton). Επιπλέον, και τα δύο πρωτόκολλα είχαν ως αποτέλεσμα τη δημιουργία βιοϋλικού συμβατού με τα ενδοθηλιακά κύτταρα κατά την επαφή τους με την επιφάνειά τους.