Transcriptional regulation by v-ErbA, the oncogenic counterpart of thyroid hormone receptor (TR)

Abstract

Thyroid hormone (T3) exhibits a vast array of profound effects on homeostasis, development, amphibian metamorphosis, differentiation and neoplasia. The action of T3 is mediated via its binding to the cognate thyroid hormone receptor (TR) which in turn binds to specific DNA sequences called thyroid responsive elements (TREs). TR in the presence of T3 activates transcription while unliganded TR leads to repression utilizing a multitude of mechanisms to regulate transcription. The v-ErbA oncoprotein is a mutated viral variant of TRα encoded by the Avian Erythroblastosis virus (AEV). The co-operation of v-erbA with v-erbB, the second oncogene of AEV with tyrosine kinase activity, leads to fatal erythroleukemia as a result of enhanced proliferation and arrest of differentiation. Due to mutations, v-ErbA cannot bind T3 hormone and thus it cannot activate transcription like TR its cellular counterpart. The hypothesis that v-ErbA behaves as a constitutive unliganded TR is attractive but not consistent with a number of experimental observations. The aim of the studies in the present thesis is to unravel the molecular mechanisms that constitute the oncogenic activity of v-erbA.Using DNase I hypersensitive site mapping we identified two candidate regions (designated HS1 and HS2) to convey transcriptional regulation of the erythroid gene carbonic anhydrase II (CA II) by v-erbA. HS1 is located 7 kb upstream while HS2 is located 8 kb downstream the transcription start site within the second intron. Immunoprecipitation of v-ErbA/DNA complexes and in vitro and in vivo footprinting experiments demonstrated that the intronic HS2 region has a binding site for v-ErbA (VRE). Interestingly, the in vivo occupancy of the VRE by v-ErbA coincides with CA II repression while this binding is alleviated when cells are triggered to differentiation and CA II is up regulated. Using mutagenesis analysis and transfection experiments we demonstrated that the HS2 region activates transcription independent of the position and the orientation relative to promoters, and that the enhancer activity of HS2 is governed by erythroid-specific factors that bind to GATA sequences located adjacently to VRE. Thus, v-ErbA appears to neutralize the positive activity of erythroid specific GATA-factors and HS2 behaves as a potent erythroid specific enhancer that is repressed by v-ErbA. We also showed that the chromatin architecture of HS2 can be modulated by liganded TR in erythroid progenitor cells and that v-ErbA occludes liganded TR from binding to VRE resulting in ablation of the T3-induced activation. This feature of v-ErbA correlates very well with its observed oncogenic activity. Using immunoprecipitation assays we showed that v-ErbA can interact with the endogenous transcriptional co-repressor NCoR. However, NCoR is not crucial for the v-ErbA mediated repression, while other co-repressor might be more potent in v-ErbA complexes. In summary, our studies have provided new insight into the mechanism of the v-ErbA-mediated transcriptional repression, that is by specifically regulating the HS2 intronic enhancer of the erythroid specific CA II gene and modulating its chromatin architecture via interactions with other proteins and presented potential mechanisms that explain the role of v-erbA in leukemic transformation.

Η θυρεοειδής ορμόνη (Τ3) παίζει πολλαπλό και σημαντικό ρόλο στην ομοιόσταση, στην ανάπτυξη, στην μεταμόρφωση των αμφίβιων, στη διαφοροποίηση και στη νεοπλασία. Η δράση της Τ3 διενεργείται μέσω της σύνδεσής της με τον υποδοχέα θυρεοειδούς ορμόνης (TR), ο οποίος με τη σειρά του συνδέεται σε ειδικές αλληλουχίες DNA που ονομάζονται στοιχεία απόκρισης στη θυρεοειδή ορμόνη (TREs). Ο TR παρουσία Τ3 ενεργοποιεί τη μεταγραφή ενώ χωρίς ορμόνη ο TR την καταστέλλει χρησιμοποιώντας πληθώρα μηχανισμών. Η v-ErbΑ ογκοπρωτεϊνη είναι μια ιική μεταλλαγμένη παραλλαγή του TRα που κωδικοποιείται από τον ιό της ερυθροβλάστωσης των πτηνών (AEV). Η συνεργασία του v-erbA με το v-erbB, το δεύτερο ογκογονίδιο του AEV με δραστικότητα κινάσης τυροσίνης, οδηγεί σε ερυθρολευχαιμία ως αποτέλεσμα του ανεξέλεγκτου πολλαπλασιασμού και της παύσης της διαφοροποίησης. Λόγω μεταλλάξεων, το ν-erbΑ δεν μπορεί να δεσμεύσει Τ3 και έτσι δεν μπορεί να ενεργοποιήσει τη μεταγραφή, όπως το κυτταρικό ομόλογό του, ο TR. Η υπόθεση ότι το v-ErbA συμπεριφέρεται ως TR χωρίς προσδεμένη ορμόνη είναι ελκυστική, αλλά αντιβαίνει σε μια σειρά από πειραματικές παρατηρήσεις. Ο στόχος των μελετών της παρούσας διατριβής είναι να διαλευκάνουν τους μοριακούς μηχανισμούς που υπαγορεύουν την ογκογόνο δράση του v-erbA.Χρησιμοποιώντας χαρτογράφηση υπερευαισθησίας σε DNAάση Ι εντοπίσαμε δύο υποψήφιες περιοχές (HS1 και HS2) ρύθμισης της μεταγραφής του ερυθροειδικού γονιδίου της καρβονικής ανυδράσης ΙΙ (CA II) από το v-erbA. Η HS1 βρίσκεται 7 kb ανοδικά (3’) ενώ HS2 βρίσκεται 8 kb καθοδικά (5’) της θέσης έναρξης μεταγραφής, εντός του δεύτερου ιντρονίου. Πειράματα ανοσοκατακρήμνισης συμπλόκων v-ErbA/DNA καθώς και in vitro και in vivo footprinting πειράματα απέδειξαν ότι η ιντρονική περιοχή HS2 έχει μία θέση δέσμευσης για v-ErbΑ (VRE). Σημαντικό είναι ότι η in vivo κατάληψη του VRE από το v-ErbΑ συμπίπτει με καταστολή της μεταγραφής της CA ΙΙ, ενώ όταν τα κύτταρα ενεργοποιούνται για διαφοροποίηση και εκφράζεται η CA II, τότε το v-ErbA δεν προσδένεται στο VRE. Χρησιμοποιώντας ανάλυση μεταλλαξιγένεσης και πειράματα επιμόλυνσης κυττάρων αποδείξαμε ότι η περιοχή HS2 ενεργοποιεί τη μεταγραφή ανεξάρτητα από τη θέση και τον προσανατολισμό της σε σχέση με υποκινητές, και ότι η δραστικότητα ως ενισχυτή της HS2 εξαρτάται από ερυθροειδικούς παράγοντες που προσδένονται στις GATA αλληλουχίες που βρίσκονται γειτονικά στο VRE. Έτσι, το ν-ErbΑ φαίνεται να εξουδετερώνει την θετική μεταγραφική δραστικότητα των ερυθροειδικών GATA-παραγόντων και η HS2 συμπεριφέρεται ως ισχυρός ερυθροειδικός ενισχυτής που καταστέλλεται από το v-ErbΑ. Δείξαμε επίσης ότι η αρχιτεκτονική της χρωματίνης της HS2 ρυθμίζεται από το δεσμευμένο με ορμόνη TR σε ερυθροειδή πρωταρχικά κύτταρα και ότι το v-ErbΑ εμποδίζει την πρόσδεση του δεσμευμένου με ορμόνη TR στο VRE, με αποτέλεσμα την άρση της μεταγραφικής ενεργοποίησης που προκαλεί η Τ3. Αυτή η δράση του v-ErbA μπορεί να συσχετίζεται με την παρατηρούμενη ογκογονικότητά του. Με πειράματα ανοσοκαθίζησης δείξαμε επίσης ότι το v-ErbΑ μπορεί να αλληλεπιδράσει με τον ενδογενή συν-καταστολέα της μεταγραφής, τον NCoR. Ωστόσο, ο NCoR δεν φαίνεται να είναι ζωτικής σημασίας για την καταστολή μέσω ν-ErbΑ, ενώ άλλοι συν-καταστολείς μπορεί να είναι πιο δραστικοί σε σύμπλοκα με το ν-ErbA.Συμπερασματικά, οι μελέτες μας δίνουν νέα δεδομένα για τον μηχανισμό με τον οποίο το ν-erbΑ καταστέλλει τη μεταγραφή, δηλαδή μέσω της ρύθμισης του ιντρονικού ενισχυτή HS2 του ερυθροειδικού γονιδίου της CA II και διαμορφώνοντας την αρχιτεκτονική της χρωματίνης στην περιοχή της CA II μέσω αλληλεπιδράσεων με άλλες πρωτεΐνες, και παρουσιάζουν πιθανούς μηχανισμούς που εξηγούν το ρόλο του v-erbΑ στο λευχαιμικό μετασχηματισμό.