Σχεδιασμός και ανάπτυξη διαχωριστικών συστημάτων πολλαπλών μεταβλητών για τη μελέτη μηχανισμού συγκράτησης προσδιοριζόμενων ουσιών με HPLC: εφαρμογή σε μόρια με φαρμακολογική δράση

Abstract

The object of the thesis is the study of the chromatographic behavior of a large number of compounds (with or without pharmacological effect). The main goal is to set the rules that determine their behavior. For this purpose, High Performance Liquid chromatography is used, in order to investigate the mechanism(s) prevailing and therefore affect the retention of compounds on chromatographic columns. Four different stationary phases were used for the study of 135 analytes (simple organic molecules or drugs). The first three are reversed-phase stationary phases (phenyl, butyl and cyano), while there is an attempt to study the same number of compounds using hydrophilic interaction liquid chromatography. Evaluation of the results is made using chemometric methods via multivariate linear regression. The methods applied are principal component analysis and partial least squares regression to latent structures. The models developed, provide information on the correlation of the descriptors with the retention time of the analytes (response). The descriptors include: a. physicochemical properties of the mobile phase, b. physicochemical properties of the analytes and c. structural features of the analytes. The results showed that in the case of reversed phase columns the retention time of the analytes is mainly determined by their lipophilicity or their molecular size (molar volume, polarizability, refractivity and the presence of large goups or condensed rings). On the contrary, the elution is faster for analytes with hydrophilic character (high solubility or hydrophilicity values), or due to the analytes’ polarity (high polar surface area and dipole moment), or because of the presence of carboxylic or hydroxylic groups. The impact of each of the above descriptors is not the same for all reversed phase columns studied, while differences in the chromatographic behavior are observed when there is a change in the composition of the mobile phase (different organic modifier or different mobile phase percentage). These correlations are proven to change in the case of hydrophilic interaction liquid chromatography. The elution is mainly determined by the presence of groups which are easily ionized at different pH values of the mobile phase. Thus, these compounds are retained longer due to the attraction forces between the ionized part of the column ligand. Lipophilicity is no longer the descriptor prevailing in the retention but the size of an analyte remains a determinant factor of delayed elution. Finally, there was an attempt of simulating the stationary phase with a tissue in order to develop a model that would predict whether a drug can be distributed in a tissue via passive transfer or diffusion. Such a model will be gradually enriched with new data in order to create a database which will describe the ability of a drug to be absorbed and distributed and also it might give an alternative experimental approach for the estimation of these properties. Based on such databases, researchers could use the information provided to avoid synthesis of compounds that are not drug-like.

Αντικείμενο της διατριβής αποτελεί η μελέτη της χρωματογραφικής συμπεριφοράς μεγάλου αριθμού ουσιών με ή χωρίς φαρμακολογική δράση. Βασικός στόχος είναι η εύρεση βασικών κανόνων που καθορίζουν τη συμπεριφορά τους. Για το σκοπό αυτό, χρησιμοποιείται η υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης έτσι ώστε να διερευνηθούν οι μηχανισμοί που επικρατούν και επηρεάζουν την συγκράτηση ουσιών στις χρωματογραφικές στήλες. Η ανάλυση πραγματοποιήθηκε σε τέσσερις στατικές φάσεις για 135 χημικές ενώσεις (απλά οργανικά μόρια ή/και φάρμακα). Οι τρεις από τις στήλες που χρησιμοποιούνται είναι αντίστροφης φάσης (phenyl, butyl και cyano) ενώ στην τέταρτη επιχειρείται η αντίστοιχη μελέτη με χρωματογραφία υδροφιλικών αλληλεπιδράσεων (HILIC). Τα αποτελέσματα αξιολογούνται με χημειομετρικές μεθόδους μέσω της ανάλυσης πολλαπλών μεταβλητών. Οι μέθοδοι που εφαρμόζονται είναι η ανάλυση κύριων συνιστωσών και η προβολή μερικών ελαχίστων τετραγώνων σε λανθάνουσες δομές. Στα μοντέλα που αναπτύχθηκαν γίνεται συσχέτιση των περιγραφικών μεταβλητών (μεταβλητές Χ) με το χρόνο συγκράτησης των ουσιών (μεταβλητή ή απόκριση Υ). Οι περιγραφικές μεταβλητές συμπεριλαμβάνουν α. φυσικοχημικές ιδιότητες της κινητής φάσης, β. φυσικοχημικές ιδιότητες των ουσιών και γ. δομικά χαρακτηριστικά των ουσιών. Τα συμπεράσματα που προκύπτουν είναι ότι στις τρεις στήλες αντίστροφης φάσης πρωταρχικό ρόλο στην αύξηση του χρόνου έκλουσης των ουσιών παίζει η λιποφιλικότητά τους καθώς και το μέγεθος μιας χημικής ένωσης (μοριακός όγκος, πολωσιμότητα, διαθλασιμότητα και η παρουσία ογκωδών ομάδων ή συμπυκνωμένων δακτυλίων). Αντίθετα, η έκλουση επιταχύνεται στην περίπτωση ουσιών με υδρόφιλο χαρακτήρα (υψηλές τιμές διαλυτότητας και υδροφιλικότητας), ή λόγω πολικότητας μιας ουσίας (μεγάλη πολική επιφάνεια και διπολική ροπή), ή λόγω παρουσίας στη δομή του μορίου καρβοξυλικής ή υδροξυλικής ομάδας. Η ένταση της επίδρασης των περιγραφικών μεταβλητών δεν ταυτίζεται στις τρεις στατικές φάσεις, ενώ διαφορές εμφανίζονται και όταν μεταβάλλεται η σύσταση της κινητής φάσης (αλλαγή του οργανικού διαλύτη ή του ποσοστού του οργανικού διαλύτη). Οι συσχετισμοί αυτοί αποδεικνύεται ότι μεταβάλλονται στη μελέτη των ουσιών με χρωματογραφία υδροφιλικών αλληλεπιδράσεων. Σ’ αυτήν την περίπτωση, η έκλουση καθορίζεται κυρίως από την παρουσία ομάδων που ιονίζονται στις διαφορετικές τιμές pH της κινητής φάσης και συγκρατούνται ισχυρότερα από το ιονισμένο τμήμα της στατικής φάσης. Η τιμή της λιποφιλικότητας είναι δευτερεύουσας σημασίας, όμως ο μοριακός όγκος εξακολουθεί να είναι παράγοντας καθυστερημένης έκλουσης. Τέλος, επιχειρείται προσομοίωση της στατικής φάσης με τις κυτταρικές μεμβράνες στην προσπάθεια δημιουργίας μοντέλου που θα προβλέπει τη συμπεριφορά των φαρμάκων στον ανθρώπινο οργανισμό. Ένα τέτοιο μοντέλο μπορεί σταδιακά να εμπλουτίζεται με νέα στοιχεία, ώστε μελλοντικά να αποτελέσει βάση δεδομένων που θα χρησιμεύει ως εργαλείο βάσει του οποίου θα αποφεύγεται η σύνθεση χημικών ενώσεων που δεν θα πληρούν τις προϋποθέσεις, από χημικής άποψης, να δράσουν ως φάρμακα.