Functional, structural and genetic studies on human glutamate dehydrogenases

Abstract

Background: Glutamate dehydrogenase (GDH) is an abundant mitochondrial enzyme which catalyzes the interconversion of glutamate to α-ketoglutarate. Humans possess two functional genes which encode for GDH, the ubiquitously expressed GLUD1 (coding for hGDH1) and the tissue specific GLUD2 (coding for hGDH2). The two iso-enzymes, although sharing all but 15 out of their 505 amino acids in their mature form, differ significantly in their regulation properties. hGDH2 is mainly detected on brain, kidney and testis, where it is found to co-localize with hGDH1 in the mitochondrial matrix. Both iso-enzymes operate by forming homo-hexamers, but it is currently unknown if they form hetero-hexamers at the areas where they co-localize. Besides their physiological role in metabolism, genetic alterations in the GLUD1 and GLUD2 genes have been associated with pathophysiological conditions. Specifically, mutations of the GLUD1 gene lead to the hyperinsulinism / hyperammonemia syndrome, whereas a polymorphism in GLUD2 has been associated with accelerated Parkinson’s disease age of onset. Furthermore, there is evidence that hGDH plays a role in Alzheimer’s disease associated neurodegeneration (as its overexpression leads to age associated degenerative changes in the mouse hippocampus), even though proof for this in human patients suffering from dementia is lacking.Aims: Aim of this study is to further analyze hGDH1 and hGDH2 properties by employing functional, structural as well as genetic methods. Specifically, we investigated whether hGDH1 and hGDH2 are capable of forming hetero-hexamers when they are co-expressed, and what particular properties these complexes may have. Secondly, we aimed to obtain the so far unsolved crystal structure of hGDH2 which will enable us to perform a valid and accurate comparison with hGDH1 (the structure of which is already known). Lastly, we analyzed the genetic variations’ spectrum of GLUD1 and GLUD2 genes in the well characterized Cretan Aging Cohort of 201 subjects, comprising of patients suffering from dementia and mild cognitive impairment (MCI), as well as of cognitive normal controls.Methods: To accomplish the first part of our aims, we created hetero-hexameric hGDH complexes in Sf21 cells, using the Baculovirus expression system. We employed co-immunoprecipitation and affinity chromatography to discriminate between in vitro mixtures of separately expressed hGDHs and in vivo 1:1 co-expressed hGDHs. Then we performed a series of kinetic studies to characterize the possible hetero-hexamers’ properties. For the second part, we produced hGDH2 in large-scale Sf21 cultures and we purified it to homogeneity, before crystallization by repeated trials using different methods and reagents. For the genetic studies, we obtained Whole Exome Sequencing data from 201 Cretan elderly individuals, from which 100 suffered from dementia, 20 were classified as MCI and 81 were cognitive normal controls. After characterizing their dementia related genetic background, we focused on GLUD1 and GLUD2 genes in respect to their variations.Results: In the present study we show that hGDHs can form, apart from homo-hexamers, hetero-hexameric complexes, when they are co-expressed. These hetero-hexamers possess unique enzymatic properties, which under specific conditions (absence of ADP, L-leucine activation, heat stability) are intermediate between the properties of pure hGDH1 and hGDH2 (and thus comparable to the 1:1 in vitro mixture of the two homo-hexamers), whereas they tend to resemble hGDH2’s behavior in respect with GTP and DES inhibition. In the second part of the study, we managed for the first time to produce high-quality hGDH2 crystals of 3.2Å resolution for structure characterization. In the third part of the study (genetic analysis of GLUD1 and GLUD2 genes), we found the Ser498Ala GLUD2 variant to be more common in controls (16.05%, n=81) than in patients with dementia (3.0%, n=100; p=0.003), and these results were verified by including in our analyses an additional local cohort.Conclusion: Our study raises the possibility that hGDH1 and hGDH2 form hetero-hexamers in the cells where they are co-expressed. As the functional properties of these complexes are distinct from those of homo-hexamers, this association might provide versatility to human cells by equipping them with more than two iso-enzymes. Structural studies on hGDH2 are expected, not only to explore its particularities, but also to decipher the structural basis of its enzymatic differences from its highly homologous hGDH1 iso-enzyme. Finally, in the culturally and genetically homogeneous cohort of aged adults of the island of Crete, we found that the Ser498Ala GLUD2 variant was associated with lower risk for dementia in our population.

Ιστορικό: Η αφυδρογονάση του γλουταμικού (GDH) είναι ένα άφθονο μιτοχονδριακό ένζυμο που καταλύει την αλληλομετατροπή του γλουταμικού σε α-κετογλουταρικό. Οι άνθρωποι διαθέτουν δύο λειτουργικά γονίδια τα οποία κωδικοποιούν για GDH, το απανταχού εκφραζόμενο GLUD1 (κωδικοποίηση για hGDH1) και το ιστο-ειδικό GLUD2 (κωδικοποίηση για hGDH2). Τα δύο ισο-ένζυμα, αν και μοιράζονται όλα, πλην 15 από τα 505 αμινοξέα τους στην ώριμη μορφή τους, διαφέρουν σημαντικά στις ιδιότητες ρύθμισής τους. Η hGDH2 ανιχνεύεται κυρίως στον εγκέφαλο, στο νεφρό και στους όρχεις, όπου συνεντοπίζεται με τη hGDH1 στη μιτοχονδριακή μήτρα. Και τα δύο ισο-ένζυμα λειτουργούν σχηματίζοντας ομο-εξαμερών, αλλά είναι προς το παρόν άγνωστο κατά πόσον μπορούν να σχηματίσουν και λειτουργικά ετερο-εξαμερή στις περιοχές όπου συν-εντοπίζονται. Εκτός από το φυσιολογικό ρόλο των ενζύμων στο μεταβολισμό, γενετικές μεταβολές στα γονίδια GLUD1 και GLUD2 έχουν συσχετιστεί με παθοφυσιολογικές καταστάσεις. Συγκεκριμένα, οι μεταλλάξεις του γονιδίου GLUD1 οδηγούν στο σύνδρομο υπερινσουλινισμό / υπεραμμωνιαιμία, ενώ ένας πολυμορφισμός στο GLUD2 έχει συσχετισθεί με μικρότερη ηλικίας έναρξης της νόσου του Parkinson. Επιπλέον, υπάρχουν ενδείξεις ότι η hGDH παίζει κάποιο ρόλο στον νευροεκφυλισμό που σχετίζεται νόσο του Alzheimer (καθώς υπερέκφραση του αντίστοιχου γονιδίου οδηγεί σε σχετιζόμενες με το γήρας εκφυλιστικές μεταβολές στον ιππόκαμπο ποντικού), αν και απόδειξη για αυτό σε ανθρώπους ασθενείς που πάσχουν από άνοια δεν υπάρχει μέχρι σήμερα.Στόχοι: Σκοπός της παρούσας μελέτης είναι η περαιτέρω ανάλυση των ιδιοτήτων των ενζύμων hGDH1 και hGDH2 χρησιμοποιώντας λειτουργικές, δομικές, καθώς και γενετικές μεθόδους. Συγκεκριμένα, ερευνήσαμε αν τα ένζυμα hGDH1 και hGDH2 είναι ικανά να σχηματίζουν ετερο-εξαμερή όταν συνεκφράζονται, και τι συγκεκριμένες ιδιότητες μπορεί να διαθέτουν αυτά τα μακρομόρια. Ένας δεύτερος στόχος ήταν να επιτύχουμε και να αναλύσουμε τη μέχρι σήμερα άλυτη κρυσταλλική δομή της hGDH2, η οποία θα μας επιτρέψει να πραγματοποιήσουμε μια έγκυρη και ακριβή σύγκριση με την hGDH1 (η δομή της οποίας είναι ήδη γνωστή). Τέλος, αναλύσαμε το φάσμα των γενετικών παραλλαγών των γονιδίων GLUD1 και GLUD2 γονιδίων στο καλά χαρακτηρισμένο Κρητικό Δείγμα Ηλικιωμένων 201 ατόμων, που αποτελείται από ασθενείς που πάσχουν από άνοια και ήπια γνωστική εξασθένηση (MCI), καθώς και από γνωστικά φυσιολογικά άτομα.Μέθοδοι: Για να επιτευχθεί το πρώτο μέρος των στόχων μας, έχουμε δημιουργήσει hGDH ετερο-εξαμερή συμπλέγματα σε κύτταρα Sf21, χρησιμοποιώντας το σύστημα έκφρασης του βακουλοϊού. Πραγματοποιήσαμε πειράματα συν-ανοσοκατακρήμνισης και χρωματογραφίας συγγένειας για να διακρίνουμε μεταξύ των in vitro μιγμάτων χωριστά εκφρασμένων hGDHs και των in vivo 1:1 συν-εκφρασμένων hGDHs. Στη συνέχεια πραγματοποιήσαμε μια σειρά κινητικών δοκιμασιών για να χαρακτηρίσουμε τις ιδιότητες των πιθανών ετερο-εξαμερών. Για το δεύτερο μέρος των στόχων μας, παράχθηκε το ένζυμο hGDH2 σε Sf21 καλλιέργειες μεγάλης κλίμακας και κατόπιν καθαρίστηκε σε ομοιογένεια, πριν επιτευχθεί η κρυστάλλωσή του μέσω επαναλαμβανόμενων δοκιμών, χρησιμοποιώντας διαφορετικές μεθόδους και αντιδραστήρια. Για τις γενετικές μελέτες, αξιοποιήσαμε τα δεδομένα που προέκυψαν από την αλληλουχία ολόκληρου του εξώματος σε 201 άτομα του Κρητικού Δείγματος Ηλικιωμένων ατόμων, από τα οποία 100 έπασχαν από άνοια, 20 είχαν ταξινομηθεί ως MCI και 81 ήταν γνωστκά φυσιολογικοί μάρτυρες. Μετά τον χαρακτηρισμό του γενετικού υπόβαθρου που σχετίζονται με την άνοια, επικεντρωθήκαμε στις παραλλαγές των γονιδίων GLUD1 και GLUD2.Αποτελέσματα: Στην παρούσα μελέτη δείξαμε ότι οι hGDHs μπορούν να σχηματίσουν, εκτός από ομο-εξαμερή, ετερο-εξαμερή σύμπλοκα, όταν συν-εκφράζονται. Αυτά ετερο-εξαμερή ένζυμα διαθέτουν μοναδικές ενζυμικές ιδιότητες, οι οποίες κάτω από συγκεκριμένες συνθήκες (απουσία ADP, L-λευκίνη ενεργοποίηση, θερμική σταθερότητα) είναι ενδιάμεσες μεταξύ των ιδιοτήτων του καθαρού hGDH1 και hGDH2 (και συνεπώς συγκρίσιμα με το 1:1 in vitro μίγμα των δύο ομο-εξαμερών μορφών), ενώ τείνουν να μοιάζουν με τη συμπεριφορά της hGDH2 σε σχέση με την αναστολή από GTP και από DES. Στο δεύτερο μέρος της μελέτης, επιτύχαμε για πρώτη φορά την παραγωγή υψηλής ποιότητας κρυστάλλων hGDH2 των 3.2Å για το χαρακτηρισμό της δομής της. Στο τρίτο μέρος της μελέτης (γενετική ανάλυση των GLUD1 και GLUD2 γονιδίων), βρήκαμε ότι η παραλλαγή Ser498Ala του GLUD2 εμφανίζεται συχνότερα σε φυσιολογικούς μάρτυρες (16,05%, n = 81) από ό,τι σε ασθενείς με άνοια (3,0%, n = 100? p = 0,003), και τα αποτελέσματα αυτά επιβεβαιώθηκαν με τη συμπερίληψη μιας επιπλέον τοπικής ομάδας ηλικιωμένων ατόμων στις αναλύσεις μας.Συμπέρασμα: Η μελέτη μας εγείρει την πιθανότητα ότι οι hGDH1 και hGDH2 σχηματίζουν ετερο-εξαμερή στα κύτταρα όπου συνεκφράζονται. Δεδομένου ότι οι λειτουργικές ιδιότητες αυτών των συμπλόκων είναι διακριτές από εκείνες των ομο-εξαμερών, η αλληλεπίδραση αυτή ενδέχεται να παρέχει ευελιξία στα ανθρώπινα κύτταρα, εξοπλίζοντας τα με περισσότερα από δύο ισο-ένζυμα. Οι δομικές μελέτες της hGDH2 αναμένεται, όχι μόνο να εξερευνήσουν τις ιδιαιτερότητές του, αλλά και να αποκρυπτογραφήσει τη δομική βάση των ενζυμικών διαφορών του από το υψηλά ομόλογο της ισο-ένζυμο hGDH1. Τέλος, στην πολιτισμικά και γενετικά ομοιογενή ομάδα της των ηλικιωμένων ατόμων του νησιού της Κρήτης, βρήκαμε ότι η παραλλαγή Ser498Ala του GLUD2 σχετίζεται με μειωμένο κίνδυνο για άνοια στον πληθυσμό μας.