Γλουταμική αφυδρογονάση ειδική για το νευρικό σύστημα: επίδραση ρυθμιστικών μεταλλάξεων στη βασική δραστηριότητα και τη δομή του ενζύμου

Abstract

Glutamate dehydrogenase (GDH), an enzyme central to glutamate metabolism and subject to complex allosteric regulation, exists in humans in two isoforms: the housekeeping hGDH1, encoded by the GLUD1 gene, and hGDH2, which is expressed mainly in brain and testis and encoded by GLUD2, a gene that emerged through retroposition ~20 million years ago. Despite 97% sequence homology, with only 15 aminoacid differences between hGDH1 and hGDH2, the two isoenzymes differ markedly in their properties: hGDH2 displays a substantially lower basal activity in absence of activators, increased resistance to GTP inhibition, and decreased thermostability. In this work we explore structure-function relationships of the two isoenzymes through mutagenesis and functional studies on wild-type and mutant hGDHs. We show that basal activity of hGDH2 in vitro is dependent on enzyme concentration, temperature and buffer composition. Furthermore, we show that the aminoacid differences R443S and G456A in the allosteric region of the enzyme, shown previously to diminish basal activity and to increase GTP-resistance, respectively, cannot reproduce the unique properties of hGDH2: the hGDH1- R443S/G456A double mutant has much lower basal activity and heat resistance than hGDH2, and is not activated by leucine. A chimeric enzyme, featuring all 4 aminoacid differences in the allosteric region (hGDH1-M415L/R443S/G456A/R470H), can also not reproduce the properties of hGDH2. The S174N aminoacid change, however, introduced into the R443S/G456A double mutant, makes the resulting enzyme sensitive to leucine activation and increases its basal activity and heat stability. Thus, aminoacid changes outside the allosteric region are crucial for the unique properties of hGDH2. In addition, we show that basal activity, heat stability and resistance to inhibition by estrogens are directly related, interlinked to each other properties of hGDHs. Finally, we show that a polymorphism in hGDH2 (S445A), that has been associated to accelerated onset of Parkinson’s disease, probably exerts its effect by increasing hGDH2’s basal activity and does not affect GTP inhibition. Mutations in the same region of hGDH1 (Q441R, S445L, S448P, K450E, H454Y), which cause the hyperinsulinism-hyperammonemia syndrome through increasing hGDH1’s resistance to GTP, do not have a similar effect in GTP-regulation when introduced to hGDH2, but can instead cause alterations in basal activity, depending on their exact location.

Η γλουταμική αφυδρογονάση (GDH), ένζυμο σημαντικό για το μεταβολισμό του γλουταμικού και με σύνθετη αλλοστερική ρύθμιση, υπάρχει στον άνθρωπο σε δύο ισομορφές: την πανταχού εκφραζόμενη hGDH1 εκ του γονιδίου GLUD1 και την hGDH2, εκφραζόμενη κυρίως στον εγκέφαλο και τους όρχεις, κωδικοποιούμενη από το γονίδιο GLUD2, που προέκυψε από ρετρομετάθεση πριν ~20 εκ. έτη. Παρά την κατά 97% ομολογία και τις μόλις 15 αμινοξικές διαφορές, τα δύο ισοένζυμα διαφέρουν στις ιδιότητές τους: η hGDH2 έχει αρκετά χαμηλότερη βασική δραστηριότητα απουσία ενεργοποιητών, μεγαλύτερη αντοχή στην αναστολή από GTP και μειωμένη θερμοαντοχή. Στην παρούσα μελέτη διερευνούμε σχέσεις δομής-λειτουργίας των δύο ισοενζύμων μέσω μεταλλαξιογένεσης και λειτουργικής μελέτης μεταλλαγμένων και μη hGDHs. Δείχνουμε ότι η βασική δραστηριότητα της hGDH2 in vitro εξαρτάται από τη συγκέντρωση του ενζύμου, τη θερμοκρασία και τη σύσταση του διαλύματος. Επίσης, αποδεικνύουμε ότι οι αμινοξικές αλλαγές R443S και G456A στην αλλοστερική περιοχή του ενζύμου, που έχουν συσχετισθεί σε προηγούμενη μελέτη με μηδενισμό της βασική δραστηριότητας και αυξημένη αντοχή στην αναστολή από GTP αντίστοιχα, δεν αρκούν για να εξηγήσουν τις ιδιότητες της hGDH2: Το διπλό μετάλλαγμα hGDH1-R443S/G456A έχει βασική δραστηριότητα και θερμοαντοχή πολύ χαμηλότερες της hGDH2, ενώ δεν ενεργοποιείται από λευκίνη. Ένα χιμαιρικό ένζυμο που φέρει και τις 4 αλλαγές στην αλλοστερική περιοχή (hGDH1-M415L/R443S/G456A/R470H), επίσης δεν αναπαράγει τις ιδιότητες της hGDH2. H αμινοξική αλλαγή S174N, όμως, προστιθέμενη στο διπλό μετάλλαγμα R443S/G456A, κάνει το ένζυμο δεκτικό στην ενεργοποίηση από λευκίνη, ενώ αυξάνει τη βασική δραστηριότητα και τη θερμοαντοχή του. Άρα, αμινοξικές διαφορές εκτός της αλλοστερικής περιοχής είναι κομβικές για τις ιδιότητες της hGDH2. Επίσης, δείχνουμε ότι η βασική δραστηριότης, η θερμοαντοχή και η αντίσταση στην αναστολή από οιστρογόνα συνδέονται με αναλογική σχέση μεταξύ τους. Τέλος, ο πολυμορφισμός S445A της hGDH2, που συνδέεται με ταχύτερη έναρξη Νόσου του Πάρκινσον, πιθανότατα δρά μέσω αύξησης της βασικής δραστηριότητας του ενζύμου, ενώ η αναστολή από GTP δεν επηρεάζεται. Μεταλλάξεις στην περιοχή αυτή (Q441R, S445L, S448P, K450E, H454Y) που προκαλούν σύνδρομο υπερινσουλινισμού-υπεραμμωνιαιμίας όταν επισυμβούν στη hGDH1, αυξάνοντας την αντοχή της στο GTP, δεν έχουν παρόμοιο αποτέλεσμα στη ρύθμιση της hGDH2. Μπορούν, όμως, να μεταβάλλουν τη βασική της δραστηριότητα, ανάλογα με την ακριβή τους εντόπιση.