Υποκυτταρικός προορισμός και μηχανισμοί μιτοχονδριακής στόχευσης των ανθρώπινων μορφών της γλουταμικής αφυδρογονάσης

Abstract

Mammalian glutamate dehydrogenase (GDH), an enzyme central to cellular metabolism, is present in all living organisms. During evolution, GDH acquired mitochondrial targeting and complex allosteric regulation. In mammals, GDH is among the most abundant mitochondrial proteins (constituting up to 10% of matrix proteins), although there are also suggestions for the extramitochondrial presence of this protein. In the human, GDH exists in two isoforms, hGDH1 and hGDH2, encoded by the GLUD1 and GLUD2 genes respectively, with distinct tissue and cell-type expression profile. Both isoproteins are predicted to have an unusually long N- terminal mitochondrial targeting signal (MTS), containing 53 amino acids (N53). This MTS is proteolytically removed upon translocation to mitochondria. Even though the two human GDHs share, in their mature form, high homology, their MTS are more divergent.In the first part of this PhD thesis, we studied the subcellular targeting of the two hGDH isoforms in cell lines. To this end, we constructed expression vectors, in which hGDH1 or hGDH2 was fused with the enhanced green fluorescent protein (EGFP) and used them to transfect human and mammalian cell lines. Co-transfection experiments using organelle-specific markers, followed by confocal microscopy, revealed that hGDH1 or hGDH2 co-localized with the mitochondrial marker DsRed2-Mito and to a lesser extent with the endoplasmic reticulum (ER) marker DsRed2-ER. Subcellular fractionation and immunoblotting detected two GDH-EGFP specific bands: 1) a ~90 kDa band associated with the mitochondrial fraction, corresponding to the mature hGDH-EGFP following removal of the N53, and 2) a ~95 kDa band mainly associated with the ER-containing cytosolic fraction, corresponding to the precursor hGDH-EGFP. Deletion of the N53 abolished mitochondrial targeting, thus confirming the role of N53 as a mitochondrial targeting signal.In the second part of the study, we sought to characterize the N53 sequences of hGDHs, to understand their structure and the properties that are important for efficient mitochondrial targeting. The main characteristics of the N53 of hGDHs are the positive charge and the tendency to form two α-helices (α1: N1-10 and α2:N16-32), α1 being more amphiphilic. The first helix, α1, is absolutely necessary for mitochondrial targeting, since selective deletion of the α1 helix abolished the mitochondrial import of hGDH2. Moreover, α1 but not α2, displayed autonomous mitochondrial-targeting capacity, being able to direct non-mitochondrial proteins into mitochondria. However, the efficient targeting of hGDH2 required the synergistic interaction of both helices α1 and α2, while α1 has the leading role. Those experimental findings in human cell lines were confirmed by import experiments in isolated yeast mitochondria, carried out by our collaborators in IMBB. These experiments also revealed that hGDH2 is imported and/or processed faster than hGDH1 in yeast mitochondria, supporting the concept of an enhanced mitochondrial targeting capacity of hGDH2. Moreover, the proteolytic removal of the N53 in the mitochondrial matrix was not found to be essential for the import of hGDHs in mitochondria.The last part of the study sheds light into the evolution of the GDH presequence from lower eukaryotic organisms to mammals and human. With the use of bioinformatic tools and in silico predictions, we suggest that the first evidence for the presence of a GDH cleavable mitochondrial presequence is found in the kingdom of ciliophora. In mammals, GDH presequence evolved into a larger, more complex and highly efficient targeting signal. Additionally, we propose that the α1 helix in mammals is more conserved than the α2 helix. In order to test some of the in silico predictions, we performed experimental studies looking for the mitochondrial targeting capacity of GDH presequences from different eukaryotic model organisms. Specifically we showed that the GDH presequences from T. thermophila (ciliate), C. elegans (roundworm), D. melanogaster (fly) and X. laevis (frog) could target the non mitochondrial proteins EGFP and DHFR into mitochondria. However, the GDH presequence of T. thermophila was not sufficient to target efficiently hGDH2 into mitochondria.In conclusion, the present study provides important insights into the subcellular targeting and the mechanisms that govern the mitochondrial transport of a major mitochondrial matrix protein and contributes into the understanding of the function and evolution of the mitochondrial targeting signals.

Η γλουταμική αφυδρογονάση (GDH) είναι ένα κεντρικό ένζυμο του κυτταρικού μεταβολισμού, το οποίο βρίσκεται σε όλους τους ζώντες οργανισμούς. Κατά τη διάρκεια της εξέλιξης, η GDH απέκτησε σύνθετη αλλοστερική ρύθμιση και ικανότητα μιτοχονδριακής στόχευσης. Στα θηλαστικά, η GDH είναι ένα από τα πιο άφθονα μιτοχονδριακά ένζυμα, αποτελώντας σε ορισμένες περιπτώσεις πάνω από το 10% των πρωτεϊνών της μιτοχονδριακής μήτρας. Ωστόσο, εξωμιτοχονδριακές θέσεις εντόπισης του ενζύμου έχουν επίσης προταθεί. Στον άνθρωπο, η GDH εμφανίζεται στις ισομορφές hGDH1 και hGDH2, οι οποίες κωδικοποιούνται από τα γονίδια GLUD1 και GLUD2 αντίστοιχα, και εμφανίζουν ετερογένεια ως προς το ιστο-ειδικό και κυτταρικό πρότυπο έκφρασης. Οι δύο πρωτεΐνες προβλέπεται να έχουν ένα ασυνήθιστα μεγάλο Ν-τελικό σινιάλο μιτοχονδριακής στόχευσης (MTS), αποτελούμενο από 53 αμινοξέα (Ν53), το οποίο αποκόπτεται μετά την είσοδο των πρωτεϊνών στα μιτοχόνδρια. Παρόλο που στην ώριμη τους μορφή, οι hGDH1 και hGDH2 εμφανίζουν μεγάλη ομολογία, τα MTS τους παρουσιάζουν μεγαλύτερη απόκλιση ως προς την αμινοξική αλληλουχία. Στο πρώτο μέρος της παρούσας διατριβής μελετήσαμε την υποκυτταρική εντόπιση των δύο ισομορφών της hGDH, σε κυτταρικές σειρές. Για το σκοπό αυτό κατασκευάσαμε πλασμιδιακούς φορείς έκφρασης των hGDH1 και hGDH2 σε σύζευξη με τη φθορίζουσα πρωτεΐνη EGFP και διαμολύναμε κυτταρικές σειρές ανθρώπου και θηλαστικών. Πειράματα συνδιαμόλυνσης των hGDH1-EGFP ή hGDH2-EGFP σε συνδυασμό με κατάλληλους υποκυτταρικούς δείκτες και συνεστιακή μικροσκοπία φθορισμού έδειξαν ότι οι hGDHs συν-εντοπίζονται με το μιτοχονδριακό δείκτη DsRed2-Mito, και σε μικρότερο βαθμό με το δείκτη του ενδοπλασματικού δίκτυου DsRed2-ER. Πειράματα υποκυτταρικής κλασμάτωσης και ανοσοαποτύπωσης έδειξαν ότι οι hGDHs-EGFP εντοπίζονται στο μιτοχονδριακό κλάσμα, όπου ανίχνευεται κυρίως η ώριμη τους μορφή (~90 kDa), από την οποία έχει αποκοπεί το Ν53. Αντίθετα στο κυτταροπλασματικό κλάσμα ανιχνεύεται η πρόδρομος μορφή (~95 kDa), η οποία αντιστοιχεί πιθανά στη GDH που σχετίζεται με το ενδοπλασματικό δίκτυο. Η απαλοιφή του Ν53 από το μόριο των hGDHs έχει ως αποτέλεσμα την κατάργηση της μιτοχονδριακής τους στόχευσης, επιβεβαιώνοντας το ρόλο του N53 ως μιτοχονδριακό σινιάλο στόχευσης. Στο δεύτερο μέρος της διατριβής, προσπαθήσαμε να χαρακτηρίσουμε το Ν53 των hGDHs, να κατανοήσουμε τη δομή του και τις ιδιότητες που είναι σημαντικές στη μιτοχονδριακή στόχευση. Τα κύρια χαρακτηριστικά του Ν53 είναι το θετικό φορτίο και η τάση να σχηματίζει δύο α-έλικες (α1: N1-10 και α2: N16-32), από τις οποίες η α1 είναι περισσότερο αμφιπαθής. Η πρώτη έλικα, α1, είναι απολύτως απαραίτητη για τη μιτοχονδριακή στόχευση, καθώς πειράματα απαλοιφής της α1 έλικας της hGDH2, οδηγούν σε απώλεια της μιτοχονδριακής της στόχευσης. Επιπλέον η α1, αλλά όχι η α2, αποτελεί ένα αυτόνομο σινιάλο μιτοχονδριακής στόχευσης που μπορεί να οδηγήσει μη μιτοχονδριακές πρωτεΐνες στα μιτοχόνδρια. Ωστόσο, για την αποτελεσματική είσοδο των hGDHs στα μιτοχόνδρια είναι απαραίτητη η συνεργασία μεταξύ των δύο ελίκων, α1 και α2, αν και η α1 έχει τον πρωταγωνιστικό ρόλο. Τα πειράματά μας επιβεβαιώθηκαν από παράλληλα πειράματα εισόδου σε απομονωμένα μιτοχόνδρια σακχαρομύκητα από συνεργάτες του Ινστιτούτου Μοριακής Βιολογίας και Βιοτεχνολογίας, που επιπλέον διαπιστώσανε ότι η hGDH2 εισέρχεται και/ ή ωριμάζει ταχύτερα στα μιτοχόνδρια του σακχαρομύκητα σε σχέση με τη hGDH1. Επιπρόσθετα, τα πειράματα στο σακχαρομύκητα έδειξαν ότι η πρωτεολυτική αποκοπή του Ν53 δεν είναι απαραίτητη για την μιτοχονδριακή στόχευση των hGDHs. Το τελευταίο τμήμα της εργασίας ρίχνει φως στην εξέλιξη του μιτοχονδριακού σινιάλου στόχευσης της GDH, από τους κατώτερους ευκαρυωτικούς οργανισμούς προς τα θηλαστικά και τον άνθρωπο. Χρησιμοποιώντας έναν συνδυασμό προγραμμάτων βιοπληροφορικής και in silico προβλέψεων μιτοχονδριακής στόχευσης, προτείνουμε ότι η εμφάνιση αποκοπτόμενου MTS για τη GDH πιθανώς ξεκίνησε από τα βλεφαριδοφόρα πρωτόζωα. Στη GDH των θηλαστικών, το MTS εξελίχθηκε σε ένα μεγαλύτερο, δομικά πολυπλοκότερο και ισχυρότερο σινιάλο στόχευσης. Επιπρόσθετα, διαπιστώσαμε ότι η α1 έλικα στα θηλαστικά είναι περισσότερο συντηρημένη σε σχέση με την α2 έλικα. Για να ελέγξουμε πειραματικά μερικές από τις in silico προβλέψεις, μελετήσαμε την ικανότητα μιτοχονδριακής στόχευσης των MTS των GDH διαφορετικών ευκαρυωτικών οργανισμών-μοντέλων. Συγκεκριμένα, δείξαμε ότι τα MTS της GDH των οργανισμών T. thermophila (βλεφαριδοφόρο), C. elegans (νηματώδης), D. melanogaster (μύγα) and X. laevis (αμφίβιο) είναι ικανά να στοχεύσουν τις μη μιτοχονδριακές πρωτεΐνες EGFP και DHFR στα μιτοχόνδρια. Αντίθετα, βρέθηκε ότι το MTS της T. thermophila αδυνατεί να στοχεύσει αποδοτικά την hGDH2 στα μιτοχόνδρια.Συμπερασματικά, η παρούσα μελέτη παρέχει σημαντικές γνώσεις ως προς την υποκυτταρική στόχευση και τους μηχανισμούς εισόδου στα μιτοχόνδρια μίας από τις κυριότερες πρωτεΐνες της μιτοχονδριακής μήτρας και βοηθάει στην καλύτερη κατανόηση της λειτουργίας και της εξέλιξης των σινιάλων στόχευσης των μιτοχονδριακών πρωτεϊνών.