HSP70: μηχανισμός ρύθμισης της απόπτωσης και μετανάστευσης των MCF7 καρκινικών κυττάρων

Abstract

The heat shock protein Hsp70 (HSPA1A: heat shock protein family A (Hsp70) member 1A) is the most thoroughly studied and analyzed protein in the A-family of the Hsp70s. Hsp70 is a survival and anti-apoptotic protein, related to a huge number of human diseases. Specifically, in cancer tumor cells, Hsp70 is expressed in high concentrations. The current study is focused on the action and the connection of Hsp70, both to the apoptosis, which is induced by the absence of cell adhesion (anoikis) and simultaneously plays a key role in the metastasis procedure and to it’s connection with the promotion of metastasis. The almost complete silencing of Hsp70 was eventually achieved, at the MCF7 cancer cell line. Initially, the survival ratio of these cancer cells was measured under constantly increasing heat shock. It was observed that the cells, that Hsp70 was absent, were more thermo sensitive, and additionally had a lower colony creation capability and a higher apoptotic possibility. Onwards, the involution of the chemotherapeutic drugs doxorubicin and cisplatin proved that doxorubicin is more toxic than cisplatin, regarding the MCF7 cells. Also, doxorubicin and cisplatin can act cooperatively when the expression of Hsp70 is absent from the MCF7 cell line.Studying anoikis apoptosis, utilizing the poly-HEMA solution, which is a substance that prohibits the adhesion of the cell at the culture plate, has led to the proof of the involvement of phospho-p53 (Serine 15) to the anoikis apoptosis. An important step, towards the progress of our investigation, was the observation that in the very same cells (MCF7-siRNA-Hsp70), from which Hsp70 was absent, displayed a much faster proliferation rate, along with greater migration capability. Morphologically, following the silencing of Hsp70 protein, the cells appear to be more lengthy and flattened. Based on the epithelial and mesenchymal markers (Ε-cadherin, Slug, Vimentin, N-cadherin), western blotting experiments and immunofluorescence in a confocal microscope, this morphological change was studied. It was proved that the absence of the Hsp70 protein expression, from the MCF7 cell line, is forcing the cells to transit from epithelial to mesenchymal (epithelial to mesenchymal transition – EMT). This transition is forcing the tumor cells to a state of higher migration capability (migration). If these results are reduced at in vivo conditions, then it can be easily assumed that the absence of Hsp70 protein is promoting the migration of tumor cancer cells. In the contrary, the presence of Hsp70 maintains the cancer cells attached to the initial tumor. According to the proposed model, p53 is phosphorylated, during the process of the cells’ detachment, to phospho-p53 (Serine 15), which forces the tumor cells that are detached for metastasis, to their death. Simultaneously, Hsp70 is preventing the promotion of metastasis, through-p53. So, these two proteins, phospho-p53 and Hsp70, act as an anti-migratory or anti-metastatic factor and their involvement in both pathways, anoikis and metastasis, will play an important role at the cure of the breast cancer, at least.

Η πρωτεΐνη θερμικού σοκ Hsp70 (HSPA1A: heat shock πρωτεΐνη οικογένειας A (Hsp70) μέλος 1A) είναι η καλύτερα μελετημένη πρωτεΐνη στην οικογένεια A των Hsp70s. Πρόκειται για μια πρωτεΐνη επιβίωσης και πρωτεΐνη αντι-αποπτωτική, που σχετίζεται με πολλές ασθένειες στον άνθρωπο. Μεταξύ αυτών, ο καρκίνος, τα καρκινικά κύτταρα του οποίου συνήθως την εκφράζουν σε υψηλές ποσότητες. Η παρούσα μελέτη εστιάζεται στην δράση και τη σύνδεση της Hsp70, τόσο με την απόπτωση, η οποία οφείλεται στην απουσία προσκόλλησης (anoikis) και ταυτόχρονα συνιστά μέρος της διαδικασίας της μετάστασης, όσο και με την σύνδεσή της με την προώθηση της μετάστασης. Έπειτα από πολλές προσπάθειες, επιτεύχθηκε σχεδόν η παντελής αποσιώπηση της Hsp70, στην καρκινική κυτταρική σειρά MCF7. Αρχικά, μετρήθηκαν τα ποσοστά επιβίωσής των κυττάρων αυτών, υπό αυξανόμενο θερμικό σοκ. Παρατηρήθηκε ότι τα κύτταρα, από τα οποία απουσίαζε η Hsp70, ήταν πιο θερμοευαίσθητα, και με χαμηλή ικανότητα δημιουργίας αποικιών και πιο αποπτωτικά. Στη συνέχεια, η εμπλοκή των χημειοθεραπευτικών ουσιών δοξορουβικίνης και σισπλατίνης έδειξε πως η δοξορουβικίνη είναι πιο τοξική από την σισπλατίνη στα MCF7 κύτταρα. Επίσης, δρουν συνεργιστικά όταν η έκφραση της Hsp70 απουσιάζει από την κυτταρική σειρά MCF7. Η μελέτη της anoikis απόπτωσης, με ενεργοποιητή την ουσία poly-HEMA, ουσία η οποία εμποδίζει την προσκόλληση των κυττάρων στο ταπήτιο των τρυβλίων, οδήγησε στην απόδειξη περί εμπλοκής της phospho-p53 (Ser15) στην απόπτωση λόγω anoikis. Σημαντικό βήμα στην εξέλιξη της έρευνας ήταν η παρατήρηση ότι τα ίδια κύτταρα (MCF7-siRNA-Hsp70), από τα οποία απουσίαζε η Hsp70, παρουσίαζαν γρηγορότερο ρυθμό πολλαπλασιασμού, αλλά και μεγαλύτερη μεταναστευτική δραστηριότητα. Μορφολογικά, έπειτα από την αποσιώπηση της πρωτεΐνης Hsp70, τα κύτταρα παρουσιάζονταν πιο επιμήκη και πεπλατυσμένα. Βασιζόμενοι σε επιθηλιακούς και μεσεγχυματικούς δείκτες (Ε-καδερίνης, Slug, βιμεντίνη, Ν-καδερίνη) και σε πειράματα ανοσοαποτύπωσης κατά western και ανοσοφθορισμού σε συνεστιακό μικροσκόπιο, μελετήθηκε αυτή η φαινοτυπική αλλαγή. Αποδείχθηκε ότι η απουσία της έκφρασης της πρωτεΐνης Hsp70, από την κυτταρική σειρά MCF7, ωθεί τα κύτταρα να μεταπίπτουν από επιθηλιακά σε μεσεγχυματικά (φαινόμενο επιθηλιακής προς μεσεγχυματικής μετάπτωσης - ΕΜΤ). Η μετάπτωση αυτή ωθεί τα καρκινικά κύτταρα σε αυξημένη ικανότητα μετανάστευσης (migration). Αν τα αποτελέσματα αυτά τα αναγάγουμε σε in vivo συνθήκες, τότε θα μπορούσαμε να υποθέσουμε ότι η απουσία της Hsp70 πρωτεΐνης προάγει την μετάσταση των καρκινικών κυττάρων. Αντίθετα, η παρουσία της Hsp70 συγκρατεί τα καρκινικά κύτταρα στον αρχικό όγκο. Σύμφωνα με το προτεινόμενο μοντέλο η p53 φωσφορυλιώνεται, κατά την διάρκεια της αποκόλλησης των κυττάρων, σε phospho-p53 (Ser 15), η οποία ωθεί τα κύτταρα, που αποκολλούνται προς μετάσταση, στον θάνατο. Ταυτόχρονα, η Hsp70 εμποδίζει την μέσω p53 προαγωγή της μετάστασης. Έτσι οι δύο πρωτεΐνες, δηλαδή οι phospho-p53 και Hsp70, δρουν αντι-μεταναστευτικά ή αντι-μεταστατικά και η εμπλοκή τους στα δύο μονοπάτια, anoikis και metastasis, θα παίξει σημαντικό ρόλο τουλάχιστον στην θεραπεία του καρκίνου του μαστού.