Ο ρόλος του TNFα στην απόπτωση των ψωριακών κερατινοκυττάρων

Abstract

Psoriasis is a common immune-mediated skin disease affecting about 3-5% of the western population. The prominent role of the TNFα as a key mediator of the disease has been proven by the efficacy of the therapies that inhibit its activity. Prompted by previous results of our group we intended to further identify the effects of TNF-blockade in the apoptosis of the psoriatic keratinocytes. Serial biopsies from psoriasis patients before and during the treatment with infliximab were obtained and immunohistolically stained for the apoptotic proteins P53, AIF, Bax, NFκB, Bcl-2 and BCLXL. A computerized system of pixelwise image analysis of the stainings was established. The epidermal thickness was digitally estimated and correlated with the clinical index PASI. Furthermore, primary isolated normal human keratinocytes were cultured with or without TNFα and then treated with infliximab. Cell proliferation assay, Apoptosis-ELISA, cytotoxicity assay and western-blot for the quantification of apoptotic proteins were performed.The digital analysis system provided parametrical values of the stainings, allowing in this way, the in-depth characterisation of the differences in the expression of the proteins within the different epidermal compartments throughout the treatment.A statistically significant upregulation of the proapoptotic proteins simultaneously with a downregulation of the antiapoptotic proteins have been observed. Before treatment a remarked difference compared with the non-lesional skin could be shown. However, after treatment lesional skin simulates the non-lesional skin. The expression of the apoptotic proteins differed significantly between the distinct epidermal compartments. PASI score was significantly correlated to the epidermal thickness at the predetermined time-points. In the level of the keratinocyte cultures decreased proliferation and increased apoptotic rates could be observed after the treatment with infliximab in TNFα pre-treated cells. The effect seemed to be driven by the NFκB proceeding. However, the in vitro model failed to simulate the in vivo conditions.In the present project, it could be shown that anti-TNF treatments – besides their immunemodulating effects – they influenced the impaired apoptotic balance of the psoriatic keratinocytes. Proapoptotic proteins (P53, AIF, Bax) were upregulated, whereas the antiapoptotic ones (NFκB, Bcl-2, BclXL) were suppressed, inciting the keratinocytes to overcome the resistance to apoptotic stimuli. These events occurred in line with the restoration of the epidermal architecture and the decrease of the epidermal thickness correlated with the improvement of the PASI score. The in vitro experiments verified the apoptotic effect of TNF-blockade.

Η ψωρίαση αποτελεί μια συχνή φλεγμονώδη δερματοπάθεια με επίπτωση περίπου 3-5% στον δυτικό πληθυσμό. Τον εξέχοντα ρόλο του ΤΝFα ως κύριου μεσολαβητή της πάθησης αποδεικνύει η αποτελεσματικότητα των θεραπειών που αναστέλλουν τη δράση του. Βασιζόμενοι σε προηγούμενα αποτελέσματα της ομάδας μας επιδιώξαμε να προσδιορίσουμε περαιτέρω την επίδραση της αναστολής του ΤΝFα στην απόπτωση των ψωριασικών κερατινοκυττάρων. Διαδοχικές βιοψίες ελήφθησαν από ασθενείς με ψωρίαση πριν και κατά τη διάρκεια θεραπείας με infliximab και στη συνέχεια έγινε ανοσοϊστοχημική χρώση αυτών με αντισώματα για τις αποπτωτικές πρωτεϊνες P53, AIF, Bax, NFκB, Bcl-2 και BCLXL. Για την ανάλυση τους εγκαθιδρύθηκε ένα υπολογιστικό σύστημα βασιζόμενο στην ψηφιακή ανάλυση εικονοστοιχείων. Το πάχος της επιδερμίδας εκτιμήθηκε επίσης ψηφιακά. Παράλληλα, πρωτογενή φυσιολογικά ανθρώπινα κερατινοκύτταρα καλλιεργήθηκαν υπό ή χωρίς την παρουσία ΤΝFα και έπειτα προστέθηκε infliximab. Ακολούθησε ανάλυση του κυτταρικού πολλαπλασιασμού και της κυτταροτοξικότητας καθώς και ELISA για απόπτωση και ανοσοαποτύπωση κατά Western για την ποσοτικοποίηση των αποπτωτικών πρωτεϊνών. Με την ψηφιακή ανάλυση προέκυψαν παραμετρικές τιμές από την εκτίμηση των ανοσοϊστοχημικών χρώσεων, επιτρέπoντας έτσι την λεπτομερή ανάλυση της έκφρασης των πρωτεϊνών στα επιμέρους διαμερίσματα της επιδερμίδας κατά τη διάρκεια της θεραπείας. Παρατηρήθηκε στατιστικά σημαντική αυξορρύθμιση των προαποπτωτικών πρωτεϊνών και συγχρόνως μειορρύθμιση των αντιαποπτωτικών πρωτεϊνών. Πριν από τη θεραπεία η διαφορά της ψωριασικής από την φυσιολογική επιδερμίδα ήταν σημαντική. Ωστόσο, μετά τη θεραπεία η ψωριασική επιδερμίδα προσομοίαζε την φυσιολογική. Ο κλινικός δείκτης PASI συσχετίστηκε σημαντικά με το πάχος της επιδερμίδας στα προκαθορισμένα χρονικά σημεία. Στο επίπεδο των κυτταρικών καλλιεργειών παρατηρήθηκε ελάττωση στον πολλαπλασιασμό και αύξηση στην απόπτωση των κερατινοκυττάρων στα οποία προστέθηκε infliximab μετά από προεπώαση με TNFα. Στο αποτέλεσμα αυτό φαίνεται να συμμετέχει το σηματοδοτικό μονοπάτι του NFκB. Παρόλα αυτά, το in vitro μοντέλο απέτυχε να προσομοιώσει τις in vivo συνθήκες.Στην παρούσα μελέτη αποδείχθηκε ότι η θεραπεία με αντι- TNF παράγοντες, εκτός από την ανοσορρυθμιστική τους δράση, επηρεάζουν την διαταραγμένη αποπτωτική ισορροπία των κερατινοκυττάρων. Μετά τη θεραπεία, οι προαποπτωτικές πρωτεϊνες (P53, AIF, Bax) αυξήθηκαν ενώ οι αντιαποπτωτικές (NFκB, Bcl-2, BclXL) ελαττώθηκαν, προτρέποντας έτσι τα κερατινοκύτταρα στην υπερνίκηση της αντίστασης κατά των αποπτωτικών ερεθισμάτων. Τα γεγονότα αυτά συνόδευσε η αποκατάσταση της αρχιτεκτονικής της επιδερμίδας, όπου η ελάττωση του επιδερμιδικού πάχους συσχετίστηκε σημαντικά με την βελτίωση του PASI. Τα πειράματα επιβεβαίωσαν τα αποπτωτικά αποτελέσματα του αποκλεισμού του TNFα.