Αντιμετώπιση του χρόνιου πόνου και της κατάθλιψης με τη στόχευση μακρομοριακών συμπλόκων που σχηματίζουν οι Rgs πρωτεΐνες

Abstract

H παρούσα μελέτη έχει στόχο την κατανόηση του κυτταρικού μηχανισμού δράσηςαντικαταθλιπτικών φαρμάκων που ανήκουν στην κατηγορία των τρικυκλικώναντικαταθλιπτικών (ΤΚΑ) ή σε αυτή των εκλεκτικών αναστολέων επαναπρόσληψηςσεροτονίνης (ΕΑΑΣ). Συγκεκριμένα, η μελέτη χρησιμοποιεί γενετικά μοντέλα(διαγονιδιακά ζώα, στοχευμένη υπερέκφραση ή απαλειφή γονιδίων με την χρήση ιών)για να μελετήσει τους κυτταρικούς μηχανισμούς δράσης των αντικαταθλιπτικώνφαρμάκων σε καταστάσεις χρόνιου πόνου και κατάθλιψης. Στόχος είναι η κατανόησητου τρόπου που σηματοδοτικά μόρια, όπως οι πρωτεΐνες Rgs9-2 και Rgsz1, οι οποίεςείναι δυναμικοί ρυθμιστές της σηματοδότησης ντοπαμινεργικών καισεροτονινεργικών υποδοχέων αντίστοιχα, ρυθμίζουν την ανταπόκριση σεαντικαταθλιπτικά φάρμακα με έμφαση σε περιοχές του εγκεφάλου που ρυθμίζουν τηνδιάθεση και την ανταμοιβή, όπως ο επικληνής πυρήνας.Στόχος των πειραμάτων νευροπαθητικού πόνου ήταν η διερεύνηση του ρόλου τωνRgs πρωτεϊνών στις αναλγητικές δράσεις διαφόρων φαρμακευτικών ουσιών, κυρίωςτου τρικυκλικού αντικαταθλιπτικού της δεσιπραμίνης, ο προσδιορισμός τηςυπεύθυνης περιοχής του εγκεφάλου για το αποτέλεσμα αυτό καθώς και η κατανόησητου μοριακού μηχανισμού δράσης της δεσιπραμίνης. Για το σκοπό αυτόχρησιμοποιήθηκε το μοντέλο μερικού τραυματισμού νεύρου-ΜΤΝ- (SNI model) πουεπάγει τόσο μηχανική αλλοδυνία (που μετράται με von Frey test) όσο και θερμικήυπεραλγησία (που μετράται με το Hargreaves test) Το ΜΤΝ μοντέλο εφαρμόστηκε σεRgs9WT (αγρίου τύπου) και Rgs9ΚΟ (knockout) ποντίκια με επιτυχία καιδιαπιστώθηκε μία μικρή καθυστέρηση στην επαγωγή τόσο της μηχανικήςαλλοδυνίας, όσο και της θερμικής υπεραλγησίας στα Rgs9ΚΟ ποντίκια, σε σύγκριση με τα Rgs9WT αδέρφια τους. Ωστόσο, σε καταστάσεις φλεγμονώδους πόνου, όπωςκατά την εφαρμογή του CFA (Complete Freund’s adjuvant) μοντέλου, δενπαρατηρήθκε κάποια διαφορά μεταξύ γονοτύπων. Συνεπώς, η παρατηρούμενηδιαφορά αναφορικά με το ρόλο της Rgs9-2 στην παθογένεια ειδικά τουνευροπαθητικού πόνου διερευνήθηκε περαιτέρω και βρέθηκε ότι η Rgs9-2 με κάποιοτρόπο επηρεάζει την ανοσολογική αντίδραση (επίπεδα IL-1β) που προκαλείται ωςεπακόλουθο του ΜΤΝ μοντέλου στο επίπεδο του νωτιαίου μυελού.Ακολούθως, σε Rgs9WT και Rgs9ΚΟ ζώα που βρίσκονταν σε χρόνιο νευροπαθητικόπόνο εξετάστηκε η αναλγητική δράση της μορφίνης Διαπιστώθηκε ότι η μορφίνηπροκάλεσε παρόμοια αναλγητική ανταπόκριση στους δύο γονοτύπους, αλλά ταRgs9ΚΟ ποντίκια εμφάνισαν καθυστερημένη ανάπτυξη ανοχής. Για να διαλευκανθείη ειδικότητα αυτού του ευρήματος εξετάστηκε η αποτελεσματικότητα της μορφίνηςσε R7bpWT και R7bpKO ζώα που βρίσκονταν σε χρόνιο πόνο, δηλαδή σε ζώα σταοποία λείπει η πρωτεΐνη εκείνη που συγκρατεί την Rgs9-2 κοντά στηνκυτταροπλασματική μεμβράνη. Και στα ζώα αυτά διαπιστώθηκε ένας παρόμοιοςφαινότυπος αναφορικά με τις αναλγητικές δράσεις της μορφίνης, εύρημα πουενισχύθηκε ακόμα περισσότερο από βιοχημικά πειράματα στον επικληνή πυρήνα πουέδειξαν ότι η εφάπαξ χορήγηση μορφίνης ενίσχυσε σημαντικά την αλληλεπίδρασημεταξύ των δύο μορίων, χωρίς να επηρεάζει τα επίπεδα πρωτεΐνικής έκφρασης τηςR7bp σε αντίθεση με την Rgs9-2. Έτσι, φάνηκε ότι το σύμπλοκο Rgs9-2/Gβ5/R7bpλειτουργεί ως αρνητικός ρυθμιστής της επαγόμενης από τη μορφίνη αναλγητικής ανταπόκρισης. Τέλος όσον αφορά τις αναλγητικές ιδιότητες αντικαταθλιπτικών φαρμάκων,διαπιστώθηκε αξιοσημείωτη ευαισθησία των Rgs9ΚΟ ποντικών σε χρόνια χορήγησητόσο δεσιπραμίνης όσο και νορτριπτυλίνης. Βάση των συμπεριφορικών αυτώνπειραμάτων και σε μία προσπάθεια να γίνει κατανοητός ο μηχανισμός δράσης τηςδεσιπραμίνης, οι βιοχημικές μελέτες επικεντρώθηκαν στην περιοχή του ραβδωτούσώματος και συγκεκριμένα στον επικληνή πυρήνα, καθώς βρέθηκε ότι εκλεκτικάστην περιοχή αυτή ο χρόνιος πόνος προκαλεί αξιοσημείωτη μείωση των επιπέδων τηςRgs9-2 πρωτεΐνης, τα οποία επανέρχονται σε φυσιολογικά επίπεδα μετά από χρόνιαχορήγηση δεσιπραμίνης, αλλά όχι των κύριων πρωτεϊνών με τις οποίες αλληλεπιδρά(Gβ5, R7bp). Για να επιβεβαιωθεί και συμπεριφορικά ο ρόλος της Rgs9-2 τουεπικλινούς πυρήνα στη ρύθμιση της αναλγητικής δράσης της δεσιπραμίνηςχρησιμοποιήθηκαν τεχνικές γονιδιακής μεταφοράς του γονιδίου της Rgs9 είτε για τηνεπαναφορά του σε Rgs9ΚΟ ποντίκια, είτε για την υπερέκφρασή του σε αγρίου τύπουζώα, στην περιοχή του επικλινούς πυρήνα. Η στόχευση του επικλινούς πυρήναβασίστηκε και σε πρόσφατες μελέτες που κατέδειξαν το ρόλο της περιοχής στηναντίληψη του χρόνιου πόνου. Διαπιστώθηκε ότι η επαναφορά της Rgs9-2 πρωτεΐνηςστον επικλινή πυρήνα Rgs9ΚΟ ποντικών έκανε τα ζώα να συμπεριφέρονται, όπως τααγρίου τύπου αδέρφια τους. Αντίθετα, η υπερέκφραση της Rgs9-2 στην ίδια περιοχήείχε τον αντίθετο φαινότυπο, δηλαδή μειωμένη ανταπόκριση στη χρόνια θεραπεία μεδεσιπραμίνη. Τα πειράματα αυτά έδειξαν ότι η Rgs9-2 στον επικληνή πυρήναρυθμίζει αρνητικά την αναλγητική ανταπόκριση στη δεσιπραμίνη στο ΜΤΝ μοντέλονευροπαθητικού πόνου.Έχοντας προσδιορίσει την ακριβή περιοχή του ΚΝΣ από την οποία η Rgs9-2 ρυθμίζειτις αναλγητικές δράσεις της δεσιπραμίνης, μια ομάδα πειραμάτων στράφηκε στηνεπαγόμενη από τη δεσιπραμίνη ενδοκυττάρια σηματοδότηση στην περιοχή τουκοιλιακού ραβδωτού σώματος. Συγκεκριμένα, μελέτες ανοσοκατακρίμνησης έδειξανότι η χρόνια χορήγηση δεσιπραμίνης ισχυροποιεί την Rgs9-2/Gβ5 αλληλεπίδραση,γεγονός που συμβάλει στη σταθερότητα του Rgs9-2/Gβ5/R7bp ετεροτριμερούςλειτουργικού συμπλόκου. Συνεπώς με αυτόν τον τρόπο επηρεάζεται έμμεσα και ηδιαθεσιμότητα των ενεργοποιημένων Gβγ υπομονάδω. Βάσει βιβλιογραφίας, μελέτεςσε κυτταρικές σειρές είχαν δείξει ότι δύο μόρια η κινάση GRK2 και η απακετυλάσητων ιστονών 5, Hdac5, ανταγωνίζονται τη σύνδεσή τους στις ενεργοποιημένες Gβγυπομονάδες, ενώ προηγούμενες μελέτες στο εργαστήριο είχαν δείξει ότι η Rgs9-2δύναται να βρεθεί σε σύμπλοκο με την GRK2. Έτσι εξετάστηκε εάν η χρόνιαθεραπεία με δεσιπραμίνη επηρέασε τις Gβ/GRK2 και Gβ/Hdac5 αλληλεπιδράσειςπαρουσία ή απουσία της Rgs9-2. Πράγματι, η χρόνια χορήγηση χαμηλής δόσηςδεσιπραμίνης ενίσχυσε την Gβ/GRK2 αλληλεπίδραση μόνο απουσία της Rgs9.Αντίθετα, η Gβ/p-Hdac5 αλληλεπίδραση (η φωσφορυλιωμένη μορφή της Hdac5 είναικυρίως κυτταροπλασματική) ενισχύθηκε αποφασιστικά παρουσία της Rgs9 και δενσχηματίστηκε καν απουσία της. Συνεπώς, τα αποτελέσματα αυτά έδειξαν ότι η Rgs9-2 καθορίζει την επαγόμενη από δεσιπραμίνη ενδοκυττάρια σηματοδότηση έμμεσαμέσω ρύθμισης των μορίων τελεστών των ενεργοποιημένων Gβ υπομονάδων, καικατά συνέπεια μέσω ρύθμισης της κυτταροπλασματικής-πυρηνικής μετατόπισης τηςHdac5.Από την άλλη πλευρά, Rgsz1WT και Rgsz1ΚΟ ποντίκια χρησιμοποιήθηκαν σεπειράματα νευροπαθητικού πόνου, για να διαπιστωθεί ο πιθανός ρόλος της Rgsz1στις δράσεις αναλγητικών φαρμάκων, όπως μορφίνη και δεσιπραμίνη, υπό συνθήκεςχρόνιου πόνου. Διαπιστώθηκε ότι η Rgsz1 δεν επηρεάζει την επαγωγή της μηχανικήςαλλοδυνίας και της θερμικής υπεραλγησίας σε αυτό το μοντέλο χρόνιου νευροπαθητικού πόνου, ούτε παίζει κάποιο ρόλο στις αναλγητικές δράσεις τηςμορφίνης ή της δεσιπραμίνης.Αναφορικά με τα πειράματα κατάθλιψης, στόχος ήταν η διερεύνηση του ρόλου τηςRgsz1 πρωτεΐνης στις δράσεις αντικαταθλιπτικών φαρμάκων , καθώς και οπροσδιορισμός των εμπλεκόμενων περιοχών του εγκεφάλου. Οι μελέτεςεπικεντρώθηκαν στο αντικαταθλιπτικό φλουοξετίνη (εκλεκτικός αναστολέαςεπαναπρόσληψης σεροτονίνης –ΕΑΕΣ), καθώς η χρόνια θεραπεία με το τρικυκλικόαντικαταθλιπτικό δεσιπραμίνη σε καταθλιπτικά λόγω χρόνιου πόνου Rgsz1WT καιRgsz1ΚΟ ποντίκια είχε παρόμοιο αντικαταθλιπτικό αποτέλεσμα ανεξαρτήτωςγονοτύπου. Eφαρμόστηκε ένα πρωτόκολλο μέτριου στρες (με 48ωρη στέρηση τροφήςκαι 6λεπτη εκαναγκασμένη κολύμβηση) που προκάλεσε αξιοσημείωτη καταθλιπτικήσυμπεριφορά, όπως αυτή αξιολογήθηκε με το τεστ της εξαναγκασμένης κολύμβησης(ΤΕΚ-forced swim test-FST). Στα καταθλιπτικά αυτά Rgsz1WT και Rgsz1ΚΟ ζώααξιολογήθηκε η αντικαταθλιπτική δράση της εφάπαξ χορήγησης φλουοξετίνης σε δύοδιαφορετικές δόσεις. Η χαμηλή δόση φλουοξετίνης είχε αντικαταθλιπτικόαποτέλεσμα σε θηλυκά Rgsz1ΚΟ ποντίκια, αλλά όχι στα αγρίου τύπου αδέρφια τους, ενώ στην υψηλή δόση ανταποκρίθηκαν όλα τα ζώα. Συνεπώς, η καθολική απαλειφήτης Rgsz1 οδήγησε σε αυξημένη ευαισθησία στην αντικαταθλιπτική δράση τηςφλουοξετίνης. Ακολούθως χρησιμιποιήθηκαν τεχνικές γονιδιακής μεταφοράς τουγονιδίου της Cre recombinase σε Rgsz1floxed ζώα για την επίτευξη εκλεκτικήςαπαλειφής του γονιδίου της Rgsz1 σε συγκεκριμένες περιοχές του εγκεφάλου: (1)στην περιυδραγωγική φαιά ουσία (ΠΥΦΟ), ρυθμιστή του πυρήνα της ραφής –κύριαπηγή σεροτονίνης- και (2) στον επικληνής πυρήνα (ΕΠ), περιοχή εμπλεκόμενη στονευρωνικό δίκτυο της κατάθλιψης. Βρέθηκε ότι στα ΠΥΦΟ Rgsz1 conditional KOποντίκια η χαμηλή δόση φλουοξετίνης είχε σημαντικό αντικαταθλιπτικό αποτέλεσμασε σχέση με την ομάδα ελέγχου, ενώ η δόση αυτή δεν είχε κανένα αποτέλεσμα ούτεστα ΕΠ Rgsz1 conditional KO ποντίκια ούτε στην αντίστοιχη ομάδα ελέγχου. Ταπειράματα αυτά αποδεικνύουν ότι η Rgsz1 στην ΠΥΦΟ ρυθμίζει αρνητικά τηναντικαταθλιπτική δράση της φλουοξετίνης.Συμπερασματικά, η παρούσα μελέτη ανέδειξε το ρυθμιστικό ρόλο της Rgs9-2 –μέσωτου επικλινούς πυρήνα- στις αναλγητικές δράσεις της δεσιπραμίνης σε καταστάσειςχρόνιου νευροπαθητικού πόνου, φωτίζοντας ιδιαίτερα έναν από τους ενδοκυττάριουςμηχανισμούς δράσης του φαρμάκου: πώς η Rgs9-2 ρυθμίζει την ενδοκυττάριαμεταφορά του σήματος από την κυτταροπλασματική μέμβράνη μέχρι τον πυρήνα.Αξιοσημείωτα ευρήματα αποτελούν ακόμη η συμβολή της Rgs9-2 στη νευρο-ανοσολογική επικοινωνία στο επίπεδο του νωτιαίου μυελού, για την επαγωγή τουνευροπαθητικού πόνου καθώς και η ανάδειξη του ρυθμιστικού ρόλου της Rgsz1πρωτεΐνης στις αντικαταθλιπτικές δράσεις των ΕΑΕΣ μέσω της ΠΥΦΟ.