Μηχανισμοί ανθεκτικότητας των ποικιλιών σκληρού σίτου Rusticano και Grazia σε συνθήκες αλατότητας και ψύχους

Abstract

Environmental stresses arise from conditions that are unfavorable for theoptimal growth and development of plants and can be classified either as biotic orabiotic. Biotic stresses are caused by pathogens, parasites, predators and othercompeting organisms while abiotic are produced by inappropriate levels of physicalcomponents of the environment. Salinity and temperature extremes have seriouseffects on the physiology of cereal crops.Initialy, morphological parameters of two commercial durum wheat (Triticumturgidum var. durum) cultivars, Rusticano and Grazia, were studied and evaluated fortheir tolerance to salt and cold stress. Metabolomic analysis based on Ultra-highpressureliquid chromatography time-of-flight mass spectrometry (UHPLC-TOF-MS)was employed to identify differentially regulated metabolites, 48 h after exposure ofcvs Rusticano and Grazia to 200mM NaCl and 4oC. Based on the results ofcomparative analysis in Rusticano and Grazia cvs under salt and cold stressconditions, it was investigated the molecular regulation of proline biosynthesis after12, 24, 48 and 72h under both stress conditions. In order to evaluate the relativeimportance of ornithine (Orn) and glutamate (Glu) as precursors in Pro synthesis, apartial cDNA encoding Orn-δ-aminotransferase (δ-OAT), two partial cDNAs encodingδ1-pyrroline-5-carboxylate synthetase (P5CS1, P5CS2) and a partial cDNA encodingδ1-pyrroline-5-carboxylate reductase (P5CR) were isolated and sequenced fromTriticum turgidum var. durum.In the initial screening experiments, it was shown that cv Rusticano exhibitedlarger root and shoot biomass than cv Grazia. Therefore, cv Rusticano is moretolerant than cv Grazia to salt and cold stress. Metabolomic analysis revealed theimportance of twenty nine primary and secondary metabolites in the plants of bothcvs subjected to salt and cold stress. In cv Rusticano more metabolites were inducedthan in cv Grazia, under both stresses and at higher levels than cv Grazia. The onlyexception was of the amino acid proline that its levels were higher in Graziacompared to Rusticano under salt stress. Real-Time PCR analysis revealed that thegenes Tdδ-OAT, TdP5CS1, TdP5CS2 and TdP5CR that are implicated in prolinebiosynthesis are stress induced in roots and shoots of both cvs under both stressconditions. The expression of the genes was higher in the salt-tolerant cv Rusticanothan in the salt-sensitive cv Grazia while the up-regulated expression of TdP5CS1 inroots and shoots was higher than that of TdP5CS2. It’s worth mentioning that thehigher accumulation of proline in shoots of Grazia after 48 h of salt stress confirmedthe results of metabolomic analysis, while cv Rusticano accumulated more proline later than Grazia (after 72 h of salt stress treatment). Under cold stress conditions,genes were over-expressed (with the exception of TdP5CR in shoots of both cvs),yet an earlier and higher response was observed in the cold-tolerant cv Rusticano,while proline accumulation showed a peak at 24 h in tissues (roots and shoots) of cvRusticano, later than the peak of the genes’ expression. The experimental resultsindicate that glutamate pathway is dominant in salt stress induced prolineaccumulation, where TdP5CS1 seems to play more important role than doesTdP5CS2. The associated work on metabolomics analysis reveals that ornithineseems to serve as a precursor of polyamine biosynthesis. The metabolite profilingand molecular regulation of proline biosynthesis show that cv Rusticano acclimate toboth abiotic stresses better than Grazia.

Οι περιβαλλοντικές καταπονήσεις προκαλούν δυσμενείς συνθήκες για τηνανάπτυξη των οργανισμών και διακρίνονται σε βιοτικές και αβιοτικές. Οι βιοτικέςκαταπονήσεις προκαλούνται από παθογόνα, παράσιτα, αρπακτικά, ενώ οι αβιοτικέςπροέρχονται από ακραίες περιβαλλοντικές συνθήκες. Η αλατότητα και οι χαμηλέςθερμοκρασίες θεωρούνται από τους σημαντικότερους αβιοτικούς παράγοντεςκαταπόνησης των σιτηρών διότι παρεμποδίζουν την ανάπτυξη των φυτών καιπροκαλούν σοβαρές απώλειες στην γεωργική παραγωγή.Στην παρούσα διατριβή μελετήθηκε η ανάπτυξη των ποικιλιών σκληρούσίτου (Triticum turgidum var. durum), Rusticano και Grazia, που έχουν εμπορικήσημασία για τη χώρα μας, σε συνθήκες αλατότητας (100, 200 mM ΝaCl) για 5 ημέρεςκαι ψύχους (4oC) για 11 ημέρες. Στη συνέχεια, με τη χρήση υπερυψηλής απόδοσηςυγρή χρωματογραφία-φασματομετρία μάζας (UHPLC-MS) μελετήθηκε τομεταβολομικό πρότυπο του υπέργειου τμήματος των ποικιλιών μετά από 48 ώρεςκαταπόνησης των φυταρίων τους σε συνθήκες υψηλής αλατότητας (200 mM ΝaCl)και ψύχους (4oC). Βασιζόμενοι στα αποτελέσματα της μεταβολομικής ανάλυσης καιμετά από αναζήτηση σε γνωστές βάσεις δεδομένων, εντοπίστηκαν τα γονίδια πουπιθανά κωδικοποιούν για ένζυμα τα οποία εμπλέκονται στο μονοπάτι βιοσύνθεσηςτης προλίνης, και απομονώθηκαν οι cDNA κλώνοι των γονιδίων δ-OAT, P5CS1,P5CS2 and P5CR που κωδικοποιούν για τα ένζυμα αυτά στο σκληρό σιτάρι.Ακολούθως, μελετήθηκε η συσσώρευση των μεταγραφημάτων των γονιδίων σεσυνθήκες αλατότητας (100 και 200 mM ΝaCl) και ψύχους (4oC) με τη χρήση τηςαλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης πραγματικού χρόνου (Real-Time PCR) καθώςκαι η συγκέντρωση της προλίνης στο ριζικό σύστημα και το υπέργειο τμήμα τωνποικιλιών Rusticano και Grazia, μετά από 12, 24, 48 και 72 ώρες καταπόνησης.Από τις μετρήσεις των μορφολογικών παραμέτρων των φυταρίων σκληρούσίτου και των 2 ποικιλιών προέκυψε ότι η ποικιλία Rusticano είναι πιο ανθεκτική απότην ποικιλία Grazia και στους 2 παράγοντες αβιοτικής καταπόνησης. Η μεταβολομικήανάλυση του υπέργειου τμήματος των ανωτέρω ποικιλιών, μετά από εφαρμογήαλατότητας και ψύχους, οδήγησε στην ταυτοποίηση είκοσι εννέα πρωτογενών(αμινοξέα, οργανικά οξέα, λιπίδια) και δευτερογενών μεταβολιτών (κυρίως αζωτούχεςκαι φαινολικές ενώσεις). Σε σύγκριση με την ποικιλία Grazia, η ποικιλία Rusticanoπαρουσίασε ταχεία ενεργοποίηση του μεταβολισμού της στις συνθήκεςκαταπόνησης, διαφοροποίηση μεγαλύτερου αριθμού μεταβολιτών, καθώς καιυψηλότερα επίπεδα συσσώρευσης μεταβολιτών (αμινοξέων, λιπιδίων, δευτερογενώνμεταβολιτών) στο υπέργειο τμήμα της. Εξαίρεση αποτελεί, σε συνθήκες αλατότητας, η μεγαλύτερη συγκέντρωση της προλίνης στο υπέργειο τμήμα της ποικιλίας Grazia ηοποία, λόγω μεγαλύτερης ευαισθησίας της σε αυτό τον παράγοντα καταπόνησης,συσσωρεύει το συγκεκριμένο μεταβολίτη προκειμένου να επέλθει οσμωρύθμιση καινα συνεχιστούν οι μεταβολικές της διεργασίες. Aπό τη μεταγραφική μελέτη τουμονοπατιού βιοσύνθεσης της προλίνης διαπιστώθηκε ότι σε συνθήκες αλατότητας ηανθεκτικότητα της ποικιλίας Rusticano έναντι της Grazia είναι εμφανής λόγω τηςμεγαλύτερης συσσώρευσης μεταγραφημάτων των γονιδίων που εμπλέκονται στηβιοσύνθεσής της καθώς και από τα υψηλότερα επίπεδα προλίνης στο ριζικό σύστημακαι το υπέργειο τμήμα, μετά από 72 ώρες καταπόνησης. Σε συνθήκες ψύχους, ηανθεκτικότητα της ποικιλίας Rusticano έναντι της Grazia σχετίζεται με την έγκαιρη(μόλις 6 ώρες μετά την έκθεση των φυταρίων στους 4οC) συσσώρευση τωνμεταγραφημάτων των γονιδίων και τη μεγαλύτερη συσσώρευση της προλίνης στουςιστούς. Τα γονίδια TdP5CS1, TdP5CS2 και Tdδ-OAT είναι πιθανό να δρουνσυνεργιστικά στη βιοσύνθεση της προλίνης από το γλουταμινικό οξύ και την ορνιθίνηαντίστοιχα, με το γονίδιο TdP5CS1 να έχει κυρίαρχο ρόλο στη συσσώρευση τουμεταβολίτη και στις 2 συνθήκες καταπόνησης, ενώ από τα αποτελέσματα τηςμεταβολομικής ανάλυσης σε συνθήκες αλατότητας προκύπτει ότι η ορνιθίνη έχειενεργό ρόλο και στα μεταβολικά μονοπάτια της αργινίνης και των πολυαμινών.Συμπερασματικά, τα φυτάρια της ποικιλίας Rusticano παρουσιάζουν καλύτερηπροσαρμογή από τα αντίστοιχα της Grazia τόσο στην αλατότητα, όσο και το ψύχος.