Ανίχνευση μεταλλάξεων των γονιδίων NPM1 και FLT3 σε ασθενείς με οξεία μυελογενή λευχαιμία και MDS: high IPSS, int-2 κατά WHO

Abstract

Purpose: NPM1 and FLT3-mutations have a prognostic significance in patients with AML. Studies show that their co-existance can highlight subpopulations with different prognosis, important for their therapy approach and survival. The purpose of this study was to determine the incidence of the mutations in Greek patients with AML, CMML and RAEB and to detect correlations with other clinical and laboratory characteristics.Materials and methods: DNA was extracted from 140 patients – 109 with de novo and secondary AML, 12 with RAEB I, 10 with RAEB II and 9 patients with CMML. The FLT3-ITD length mutation was estimated by PCR, the point-mutation of FLT3 by PCR-RFLP and the NPM1-mutations by Fragment-analysis. We searched associations with clinical characteristics, laboratory and immunohistochemical findings and karyotype. Results: In Greek patients with AML, the incidence of the FLT3-ITD, FLT3-TKD and NPM1-mutations was 11.9%, 6.4% and 17.4% respectively. FLT3-ITD-positive patients had a more aggressive leukaemia, with higher leucocytes (p<0.001). WBC numbers higher than 60000/mm3, predicted the presence of the mutation with 90% specificity. The same patients had higher LDH-values (p=0.006). A normal LDH, excluded the mutation with 95% sencitivity. The patients were 7 times more likely to be NPM1-mutated too and their blasts had lower (<50%) expression of CD34 (p=0.008). FLT3-TKD-positive patients had often lymphadenopathy (p=0.026) and their blasts expressed CD14 (p<0.001). NPM1-mutated patients usually had de novo leukaemia (p=0.039), and higher LDH-values (p<0.001). A normal LDH, practically excluded the presence of the mutation with a 100% sencitivity. Immunohistochemically the blasts had a lower expression of CD34 (p<0.001), CD13 (p=0.009) and CD117 (p=0.003), absence of HLA-DR (p=0.038) and a higher expression of CD116 (p for linear trend<0.001), CD15 (p=0.014) and CD36 (p=0.007). The patients were 8 times more likely to carry the FLT3-ITD, but no correlation was made with the point mutation of the receptor. The incidence of the 3 mutations in MDS/MPN patients was 6.4% each.Conclusions: Greek patients with AML carry the FLT3-mutation with half the frequency compared to the literature, but the same biological characteristics. This is the same with the Nucleophosmin-mutations. The 2 mutated genes often co-exist and combine the biological characteristics of the diseases, making it necessary to always search them both in a Greek patient too. In our analysis, we saw that simple and low cost exams (WBC and LDH) can be very important for prognosis and could help the Clinical Hematologist choose the patients who are more likely to carry the mutations, lowering the cost of risk stratification. In our 31 RAEB and CMML-patients, the incidence of the three mutations is two to ten times higher than the literature, which makes greek patients with myelodysplastic syndromes ideal to research the mutations.

Εισαγωγή: Οι μεταλλάξεις των γονιδίων NPM1 και FLT3, έχουν ιδιαίτερη προγνωστική αξία σε ασθενείς με οξεία μυελογενή λευχαιμία (ΟΜΛ). Μελέτες δείχνουν ότι ο συνδυασμός των ως άνω γονιδίων, μπορεί να αναδείξει υποπληθυσμούς με διαφορετική πρόγνωση, με ιδιαίτερη σημασία για τη θεραπεία και τη συνολική τους επιβίωση. Η επίπτωση, αλλά και η κλινική σημασία των μεταλλάξεων των NPM1 και FLT3 δεν έχουν καταγραφεί σε συνδυασμό στον Ελληνικό χώρο. Σκοπός της παρούσας μελέτης είναι η μελέτη των γονιδίων σε Έλληνες ασθενείς με ΟΜΛ και Μυελοδυσπλαστικά σύνδρομα (RAEB και CMML) και η αναζήτηση πιθανών συσχετίσεων της παρουσίας των μεταλλάξεων με τα ανοσοφαινοτυπικά και λοιπά εργαστηριακά ευρήματα.Υλικό και Μέθοδοι: Απομονώθηκε γενετικό υλικό από 140 ασθενείς, 109 με ΟΜΛ και 31 με μυελοδυσπλαστικά/μυελοϋπερπλαστικά νεοπλάσματα (RAEB και ΧΜΜΛ). Η FLT3-ITD μετάλλαξη μελετήθηκε με PCR, η σημειακή μετάλλαξη με PCR-RFLP, ενώ της Νουκλεοφωσμίνης με τη μέθοδο του Fragment analysis. Καταγράφηκαν τα κλινικά και εργαστηριακά χαρακτηριστικά των ασθενών, ο καρυότυπος και η ανοσοφαινοτυπική υπογραφή των βλαστών, με κυτταρομετρία ροής. Αποτελέσματα: Στους ασθενείς με ΟΜΛ η συχνότητα εμφάνισης της FLT3-ITD, της FLT3-TKD και της μετάλλαξης της NPM1 ήταν 11,9%, 6,4% και 17,4% αντίστοιχα. Οι FLT3-ITD+ είχαν επιθετικότερη νόσο, με υψηλότερα λευκά (p<0.001), έτσι που αριθμός λευκών >60000/mm3 είχε ειδικότητα 90% για ανεύρεση της μετάλλαξης και υψηλότερη LDH (p=0.006), έτσι που φυσιολογική τιμή απέκλειε με ευαισθησία 95% την παρουσία της. Οι ασθενείς είχαν 7πλάσια πιθανότητα να έχουν και τη μετάλλαξη της NPM1 και οι βλάστες είχαν χαμηλότερη (<50%) έκφραση CD34 (p=0,008). Οι FLT3-TKD+ είχαν συνήθως λεμφαδενοπάθεια (p=0,026) και οι βλάστες τους εξέφραζαν CD14 (p<0,001). Οι NPM1+ είχαν συνήθως de novo ΟΜΛ (p=0,039) και υψηλότερη LDH (p<0,001). Μάλιστα, φυσιολογική τιμή LDH πρακτικά επέκλειε με ευαισθησία περίπου 100% την παρουσία της. Ανοσοφαινοτυπικά, οι βλάστες είχαν χαμηλότερη έκφραση CD34 (p<0,001), CD13 (p=0.009) και CD117 (p=0,003), απουσία έκφρασης HLA-DR (p=0,038), ενώ σχετίσθηκαν θετικά με την έκφραση CD116 (p for linear trend<0,001), CD15 (p=0.014) και CD36 (p=0,007). Οι ασθενείς είχαν 8πλάσια πιθανότητα να φέρουν και την FLT3-ITD, ενώ με τη σημειακή δεν συσχετίσθηκαν.Η συχνότητα των τριών μεταλλάξεων στους Μυελοδυσπλαστικούς ασθενείς ήταν 6,4% για την καθεμία. Συμπεράσματα: Οι Θεσσαλοί ασθενείς με ΟΜΛ φέρουν την FLT3-ITD μετάλλαξη με τη μισή συχνότητα από ό,τι αναφέρεται στη βιβλιογραφία, ενώ παρουσιάζουν ίδια βιολογικά χαρακτηριστικά. Το ίδιο συμβαίνει και για τις μεταλλάξεις της Νουκλεοφωσμίνης. Οι 2 μεταλλάξεις συχνότατα συνυπάρχουν, συνδυάζοντας τα βιολογικά χαρακτηριστικά των νόσων, καθιστώντας απαραίτητη τη μελέτη και των 2 γονιδίων και στους Έλληνες ασθενείς. Από την ανάλυσή μας προκύπτει επίσης, πως απλές και χωρίς ιδιαίτερο κόστος μετρήσεις (αριθμός λευκών και LDH) έχουν ίσως μεγαλύτερη σημασία για την πρόγνωση, αλλά και θα μπορούσαν να βοηθήσουν τον κλινικό Αιματολόγο στην Ελλάδα να επιλέξει σε ποιους ασθενείς να στείλει μοριακό έλεγχο, μειώνοντας το κόστος της αρχικής διάγνωσης και κατάταξης του λευχαιμικού σε ομάδα κινδύνου. Στους 31 ασθενείς με RAEB και CMML που συμπεριλήφθηκαν στη μελέτη, η συχνότητα είναι διπλάσια, εως δεκαπλάσια από ό,τι αναφέρεται στη διεθνή αρθρογραφία, το οποίο μπορεί να κάνει στους Έλληνες πιο εύκολες τις μελέτες των μεταλλάξεων σε προλευχαιμικές καταστάσεις.