Λειτουργική και γονιδιωματική ανάλυση της επίδρασης αναλόγων του ρετινοϊκού οξέος σε ανθρώπινα κερατινοκύτταρα

Abstract

The novel and patented N1,N12-Βis(all-trans-retinoyl)spermine retinoid-spermine conjugate (RASP), has been shown previously to inhibit angiogenesis and exerts anti-tumour activity on prostate cancer cell cultures. Furthermore, RASP is less toxic and non-teratogenic when administered to rats during two generations compared to all-trans retinoic acid, which exhibits substantially more severe side-effects. Ιn the current thesis we attempted to decipher the anti-cancer effect of RASP on HaCaT cells (immortalized human keratinocytes) and to identify the effect of RASP at the molecular level. To achieve that goal, we tried to determine the intracellular localization of RASP and we performed extensive transcriptomics, miRNA profiling and FACS analyses. RASP was linked with rhodamine and monitored using fluorescent microscopy. The IC50 of RASP was determined and used to supplement HaCaT culture media. Total RNA was extracted and analyzed using DNA microarrays (One Array) on a Perkin Elmer platform (ScanArray Express). The small RNAs fraction (<200 nt) was isolated with MiRVana (Ambion) and sequenced on IonTorrent platform, in triplicates. Bioinformatics analysis was performed using PARTEK suite (Life Technologies) and INGENUITY pathways (QIAGEN). Apoptosis was monitored using confocal microscopy (Nikon Eclipse TE-2000U) and DNA damage assays. FACS analysis verified the effect of RASP on apoptosis and cell cycle regulation. We identified 56 genes that are modulated by RASP and we focused on 18 of them. We also identified 21 miRNAs, mainly oncomiRs, which were downregulated and were verified via qRT-PCR. Detailed bioinformatics analysis showed interplay between miR-125b-5p, miR-130a-3p, miR-182-5p, miR-19b-3p, miR-3607-5p, miR-92a-3p and AURKA, WARS, SC5D, TNF, XIAP, PRAF2, ALDHB2. All genes affect the induction of apoptosis and interfere with different cell cycle phases. Detailed FACS analysis showed significant cell cycle arrest in G2 phase and DNA damage. Cell cultures at various steps and conditions showed extensive mitochondrial breakdown and DNA fragmentation which is also supportive for the apoptotic path of cells after exposure to RASP. Finally, qRT-PCR analysis showed variable effect on cyclins and cell cycle regulatory proteins, and a possible crosstalk between TNF signaling and p21 upregulation. Our results indicate that RASP has a strong and specific effect on the modulation of tumorigenic genes, oncomiRS and pathways, in HaCaT. Our analyses taken together with the fact that RASP exhibited minimal side-effects and toxicity in animal studies, pose it as an ideal lead compound for testing in cutaneous cancer, including melanoma. Taken together, our observations point towards a positive modulation of a broad gene array and suggest that RASP can be used in further studies as a promising anti-cancer and anti-inflammatory compound.

Τα ρετινοειδή αποτελούν μια σημαντική κατηγορία μορίων που επηρεάζουν ποικίλες βιολογικές διαδικασίες, όπως τη διαφοροποίηση των επιθηλιακών και μη-επιθηλιακών ιστών, την απόπτωση και τη ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου. Επίσης, σημαντικός είναι ο ρόλος τους στην όραση, την ανάπτυξη και την αναπαραγωγή, ενώ χρησιμοποιούνται αποτελεσματικά στην συστημική και τοπική θεραπεία διαφόρων ασθενειών όπως, η ακμή, η ψωρίαση και η οξεία προμυελοκυτταρική λευχαιμία. Τα τελευταία χρόνια υπάρχει σημαντικό ερευνητικό ενδιαφέρον σχετικά με τη δυνητική χρήση των ρετινοειδών σε άλλες παθολογικές καταστάσεις, όπως σε διάφορους τύπους καρκίνου, ενώ γίνεται χρήση του all-trans ρετινοϊκού οξέος (atRA) σε διάφορα αντι-καρκινικά θεραπευτικά σχήματα. Η πιθανή θεραπευτική αποτελεσματικότητα των ρετινοειδών στον καρκίνο ενισχύεται από στοιχεία που δείχνουν ότι τα ρετινοειδή αναστέλλουν την αγγειογένεση η οποία είναι σημαντική για την ανάπτυξη και επέκταση του όγκου. Παρόλαυτα, τα ρετινοειδή έχουν επίσης δείξει πως προάγουν την αγγειογένεση και αυτή η αντίφαση είναι πιθανόν να οφείλεται στην ποικιλότροπη επίδραση των ρετινοειδών στην έκφραση μιας πληθώρας γονιδίων. Ρετινοειδή με πιο ασφαλή χαρακτηριστικά, με αντι-αγγειογενετική και αντι-φλεγμονώδη δράση αλλά ταυτόχρονα με λιγότερες παρενέργειες θα μπορούσαν να είναι αποτελεσματικά έναντι του καρκίνου. Ο στόχος της παρούσας εργασίας είναι η μελέτη της επίδρασης της N1,N12-Bis(all-trans-retinoyl)spermine, RASP, που αποτελείται από δύο μόρια atRA ομοιοπολικά συνδεμένα στις θέσεις Ν1 και Ν12 της φυσικής πολυαμίνης σπερμίνης, στη βιωσιμότητα και τον πολλαπλασιασμό ανθρώπινων κερατινοκυττάρων, στην απόπτωση, καθώς επίσης η μελέτη της πιθανής αντιφλεμονώδους και αντικαρκινικής της δράσης, μέσω της διαλεύκανσης του μοριακού μηχανισμού δράσης της, μετά από ανάλυση ολόκληρου του γονιδιώματος με τη χρήση μικροσυστοιχιών και γονιδιωματικής ανάλυσης επόμενης γενιάς (next generation sequencing, NGS). Η σύνθεση της RASP έγινε στοχεύοντας στη βελτίωση του θεραπευτικού δείκτη, του βιολογικού προφίλ και της επιλεκτικότητας ήδη υπαρχόντων συνθετικών ρετινοειδών, μειώνοντας έτσι τις παρενέργειες και βελτιώνοντας την κλινική τους αποτελεσματικότητα. Η επίδραση της RASP σε καλλιέργειες της κυτταρικής σειράς HaCaT, δηλώνει βιοχημική δράση η οποία υποστηρίζει την μέχρι πρότινος παρατηρούμενη αντικαρκινική και αντιφλεγμονώδη δράση της RASP σε διάφορες καρκινικές κυτταρικές σειρές. Επιπρόσθετα, ένα από τα πιο σημαντικά χαρακτηριστικά της RASP που είναι η έλλειψη εμφανούς τοξικής ή τερατογόνου δράσης όταν αυτή χορηγήθηκε σε γονείς αλλά και σε δύο γενεές απογόνων επίμυων, υποστηρίζεται από τα ευρήματα της παρούσας διατριβής. Αυτό υποδηλώνει, ότι η RASP δεν διεγείρει σηματοδοτικές πορείες που επάγονται από γονοτοξικούς παράγοντες αλλά αντίθετα επιτυγχάνει και αντικαρκινική και αντιφλεγμονώδη δράση μέσω διασταυρούμενης συνομιλίας (crosstalk) του TNF με την p21. Περαιτέρω μελέτες βρίσκονται σε εξέλιξη προκειμένου να επιβεβαιώσουν όχι μόνο την υπόθεση αυτή, αλλά και τον πιθανό ρόλο πολλών μικρών ρυθμιστικών μορίων RNA (κυρίως miRNAs) των οποίων η έκφραση βρέθηκε να μεταβάλλεται σημαντικά κάτω από την επίδραση της RASP, η οποία πλέον μπορεί να θεωρηθεί ως ένα πολλά υποσχόμενο θεραπευτικό μόριο-οδηγός (lead-molecule) για την ανάπτυξη και αξιολόγηση νέων θεραπευτικών προσεγγίσεων σε διάφορους τύπους φλεγμονωδών νόσων ή καρκίνου.