Ορολογική και μοριακή επιδημιολογία των φλεβοϊών στην Ελλάδα

Abstract

Phleboviruses are endemic in many countries of Southern Europe, Asia and Africa, especially in those located around the Mediterranean sea. Three main phleboviruses circulate in the Mediterranean region: Sandfly Naples virus, (SFNV), Sandfly Sicilian virus (SFSV), and Toscana virus (TOSV).In order to estimate the prevalence of TOSV and relative phleboviruses in the Greek mainland population, serum samples of 595 healthy individuals (men, 41%), living in Northern Greece, were tested with serological methods (Elisa for the detection of IgG antibodies against TOSV and relative phleboviruses). The observed overall prevalence was 11.26 %, which varied by region from 0% to 23.5 %. The prevalence was significantly lower in children and adults less than 30 years old. In order to estimate the prevalence of TOSV and relative phleboviruses in the Greek island population, 219 sera of healthy individuals (males 45.66 %), residents of various Aegean islands were collected and tested with serological methods (Elisa for IgG antibodies against TOSV and relative phleboviruses. Antibodies (IgG) were detected in 46/219 (21 %) subjects. The islands of Evia and Samos had showed the highest prevalences (40% and 34.78 %, respectively). The IgG positive samples were further tested by a serological method IFA, which allows the simultaneous detection of antibodies against four serotypes of the genus Phlebovirus (TOSV, SFNV, SFSV, SFCV) and when the results were compared, the agreement between the two methods was 73.9 %. There was no statistically significant difference in prevalence between male and female subjects in the seroepidemiological study. In conclusion, the prevalence TOSV and relative phleboviruses was found high in both the mainland (11.26%) and the island (21%) country.Within the framework of this thesis, a retrospective and a precursor study were conducted, in patients with febrile or CNS viral infection. The retrospective serological study concerned patients with CNS infection the sera of which were collected over three years (2003-2005). IgG antibodies against TOSV and relative phleboviruses were found in 34.37 % of the samples/patients. The highest prevalence was recorded in 2004, where more than half of the samples/patients (51.9 %) were positive, while in the years 2003 and 2005 the percentage of the positive samples/patients was around 20 %. In one of these samples meningoencephalitis due to phleboviruses was diagnosed, by IgG seroconversion (sample of the 4th day negative, samples of the 17th and 19th days positive against TOSV and relative phleboviruses). The patient was an 8 year old boy admitted to hospital in June 2004, due to high fever, tachypnea, hypotonia, diarrhea and tonic-clonic seizures. As IgM antibodies against TOSV were not detected in all the three samples of the little patient, the whole clinical picture was considered as an acute CNS infection, probably caused by a phlebovirus, relative but distinct from TOSV. For the precursor study, whole blood and CSF samples from patients with acute disease (febrile or CNS viral infection), were collected and examined during the months May to October, in the years 2008-2010. Generally 2.85 % of the patients had an acute infection due to phleboviruses. Indeed, it appeared that 2.91% of the ordinary febrile and 2.70 % of the febrile with concomitant neurological symptoms or CNS infection cases were attributed to phleboviruses. Of the patients who were in the 2th to 7th days of the disease, three (2.94 %) were found to be positive (with detection of specific IgM antibodies), two positive to SFSV and one positive to SFNV. All the samples of the molecular study were negative except one, in which a new phlebovirus, Adria virus, was detected, in a whole blood sample that was taken in 2009, on the first day of the disease, in a 2,5 years-old boy hospitalized in Thessaloniki because of a febrile syndrome with uncomplicated convulsions. Genetic analysis showed that Adria virus was genetically almost identical with two strains detected in sandflies collected in Albania in 2005 and grouped in the Phlebovirus phylogenetic tree (L segment) together with the viruses of Salehabad serocomplex. Adria virus was found to be quite different genetically from the other phleboviruses of Salehabad serocomplex (19,6 % from Salehabad virus and 23.8 % from Arbia virus in the nucleotide level, viruses which have not been associated yet with causing disease in humans).In order to provide an insight into the distribution of sandflies in Greece, especially in areas demonstrably related to their activity, sandflies were collected after research with GIS (geographic information systems, GIS), from the mainland (Northern Greece) and from the island country (Corfu and Lefkas) and an attempt was made, firstly to study the distribution of Phlebotomus species in the country and secondly to detect in them phleboviruses by molecular methods. The species with the widest distribution in the islands were Ph. neglectus, Ph. similis, Ph. tobbi (Ph. perniciosus) and Ph. perfiliewi, while on the mainland were Ph. simici, Ph. neglectus and Ph. tobbi (Ph. perniciosus). In one of the female sandflies groups collected in Lefkas in 2009, the genetic material of a new phlebovirus was detected that was provisionally named Lefkas virus. This new phlebovirus was phylogenetically more closely related to the viruses of the Salehabad serocomplex, from which however differs genetically (> 25 % at the nucleotide level). .Phylogenetic analysis showed the existence of three major phylogenetic phlebovirus branches in Europe, Asia and Africa, corresponding respectively to the three serocomplexes, SFN, SFS and Salehabad. The new phleboviruses, which were molecularly detected in the context of this thesis, Adria and Lefkas viruses, are phylogenetically more closely related to the viruses of Salehabad serocomplex and considerably different (>40 % at the nucleotide level) from the already known pathogenic phleboviruses that circulate in the region (SFSV, SFNV and TOSV). The high prevalence of phleboviruses in Greece, particularly in the islands, combined with the fact that there is a small number of clinical cases attributed to them, shows that a considerable proportion of phlebovirus infections causes mild symptoms or is underdiagnosed . The detection of new phlebovirus strains, especially those who show great genetic difference from the already known pathogens of the genus Phlebovirus, marks the revision of existing data for these viruses and the need to design new diagnostic methods.

Οι φλεβοϊοί ενδημούν σε πολλές χώρες της Νότιας Ευρώπης, της Ασίας και της Αφρικής και ιδιαίτερα σε εκείνες που βρίσκονται γύρω από τη Μεσόγειο θάλασσα. Στην ευρύτερη περιοχή της Μεσογείου, κυκλοφορούν τρεις κυρίως φλεβοϊοί: ο ιός του πυρετού εκ φλεβοτόμου του τύπου της Νεάπολης (Sandfly Naples virus, SFNV), ο ιός του πυρετού εκ φλεβοτόμου του τύπου της Σικελίας (Sandfly Sicilian virus, SFSV), καθώς και ο ιός Τοσκάνα (Τoscana virus, TOSV). Προκειμένου να εκτιμηθεί ο επιπολασμός για τον TOSV και τους συγγενείς του φλεβοϊούς, στον πληθυσμό της ηπειρωτικής χώρας, ελέγχθηκαν δείγματα ορού από 595 υγιή άτομα (άνδρες, 41%), που κατοικούν στη Bόρεια Ελλάδα, με ορολογική μέθοδο Εlisa, για IgG αντισώματα έναντι αυτών. Παρατηρήθηκε γενικός επιπολασμός 11,26%, που κυμάνθηκε κατά περιοχές από 0% έως 23,5%. Ο επιπολασμός ήταν σημαντικά χαμηλότερος σε παιδιά και ενήλικες μικρότερους των 30 ετών. Για τη νησιωτική χώρα, συλλέχθηκαν και ελέγχθηκαν οι οροί 219 υγιών ατόμων, (άνδρες 45,66 %), κατοίκων διαφόρων νησιών του Αιγαίου Πελάγους με ορολογική μέθοδο Εlisa, για IgG αντισώματα έναντι του TOSV και των συγγενών του φλεβοϊών. Αντισώματα (IgG) ανιχνεύθηκαν σε 46/219 (21%) άτομα. Τα νησιά Σάμος και Εύβοια παρουσίασαν τους υψηλότερους επιπολασμούς (40% και 34,78%, αντίστοιχα). Τα IgG θετικά δείγματα εξετάστηκαν περαιτέρω, με ορολογική μέθοδο IFA, η οποία επιτρέπει την ταυτόχρονη ανίχνευση αντισωμάτων έναντι τεσσάρων οροτύπων του γένους Phlebovirus (TOSV, SFNV, SFSV, SFCV) και όταν τα αποτελέσματα των δύο μεθόδων συγκρίθηκαν, η συμφωνία μεταξύ των δύο μεθόδων ήταν 73,9%. Δεν παρουσιάστηκε στατιστικά σημαντική διαφορά στον επιπολασμό μεταξύ άρρενων και θήλεων ατόμων, στην οροεπιδημιολογική μελέτη. Συμπερασματικά ο επιπολασμός του TOSV και των συγγενών του φλεβοϊών βρέθηκε υψηλός, τόσο στην ηπειρωτική (11,26%), όσο και στη νησιωτική (21%) χώρα. Στα πλαίσια της παρούσας διατριβής πραγματοποιήθηκαν αναδρομική και πρόδρομη μελέτη σε ασθενείς με κλινική εικόνα εμπύρετης ιογενούς ή λοίμωξης του ΚΝΣ. Στην αναδρομική ορολογική μελέτη, που έγινε σε ορούς ασθενών με λοίμωξη του ΚΝΣ οι οποίοι συλλέχθηκαν την τριετία 2003-2005, σε 34,37% των δειγμάτων, βρέθηκαν IgG αντισώματα έναντι του TOSV και των συγγενών του φλεβοϊών. Ο υψηλότερος επιπολασμός σημειώθηκε το έτος 2004, όπου πάνω από το ήμισυ των δειγμάτων (51,9%) βρέθηκαν θετικά, ενώ κατά τα έτη 2003 και 2005 το ποσοστό των θετικών δείγμάτων ανήλθε γύρω στο 20%. Σε ένα από τα δείγματα αυτά, διαγνώστηκε μηνιγγοεγκεφαλίτιδα, κατόπιν IgG ορομετατροπής (δείγμα 4ης ημέρας αρνητικό έναντι του TOSV, δείγματα 17ης και 19ης ημέρας θετικά), σε ένα 8χρονο αγόρι που εισήχθη τον Ιούνιο του 2004, σε νοσοκομείο της Θεσσαλονίκης, εξαιτίας υψηλού πυρετού, ταχύπνοιας, υποτονίας, διάρροιας, και τονικοκλονικών σπασμών. Καθώς δεν ανιχνεύτηκαν IgM αντισώματα έναντι του TOSV και στα τρία δείγματα, θεωρήθηκε ότι αυτή ήταν μια οξεία λοίμωξη, που προκλήθηκε πιθανώς από έναν συγγενή φλεβοϊό, διακριτό όμως από τον ιό TOS. Για την πρόδρομη μελέτη, σε ασθενείς με οξεία νόσο (εμπύρετη ιογενή ή λοίμωξη ΚΝΣ), δείγματα ολικού αίματος και ΕΝΥ συλλέχθηκαν και εξετάστηκαν κατά τους μήνες Μάιο έως Οκτώβριο, των ετών 2008-2010. Γενικά 2,85% των ασθενών είχαν οξεία λοίμωξη οφειλόμενη σε φλεβοϊό. Μάλιστα φάνηκε ότι 2,91% των απλών εμπυρέτων και 2,70% των εμπυρέτων με συνοδό νευρολογική συμπτωματολογία ή λοίμωξη ΚΝΣ, οφείλονταν σε φλεβοϊούς. Από τους ασθενείς που βρίσκονταν στη 2η-7η ημέρα της νόσου, τρεις (2,94%) βρέθηκαν θετικοί (με ανίχνευση ειδικών IgM αντισωμάτων), δύο θετικοί έναντι SFSV και ένας θετικός έναντι SFNV. Όλα τα δείγματα της μοριακής μελέτης ήταν αρνητικά πλην ενός, στο οποίο ανιχνεύτηκε ένας νέος φλεβοϊός, ο ιός Adria, σε δείγμα ολικού αίματος που λήφθηκε την πρώτη ημέρα της νόσου. Ο νέος φλεβοϊός Adria ανιχνεύτηκε ως πιθανός αιτιολογικός παράγοντας ιογενούς εμπύρετης συνδρομής με ανεπίπλεκτους σπασμούς, σε ένα αγόρι 2,5 ετών, στη Θεσσαλονίκη, τo 2009. Η γενετική ανάλυση έδειξε ότι ο ιός Adria ήταν ταυτόσημος με στέλεχη φλεβοϊών που ανιχνεύτηκαν σε φλεβοτόμους στην Αλβανία και ομαδοποιείται στο φυλογενετικό δέντρο των φλεβοϊών μαζί με τους ιούς του οροσυμπλέγματος Salehabad. Ο ιός Adria διαφέρει αρκετά γενετικά από τους υπόλοιπους του οροσυσυμπλέγματος Salehabad (19,6% από τον ιό Salehabad και 23,8% από τον ιό Arbia σε επίπεδο νουκλεοτιδίων, οι οποίοι μέχρι σήμερα δεν έχουν συσχετισθεί με την πρόκληση νόσου στον άνθρωπο). Όσον αφορά τους φορείς των φλεβοϊών, προκειμένου να διαμορφωθεί μια εικόνα για την κατανομή των φλεβοτόμων στην Ελλάδα, ιδίως σε περιοχές που σχετίζονται αποδεδειγμένα με τη δραστηριότητα τους, φλεβοτόμοι συλλέχθηκαν μετά από έρευνα με γεωγραφικά συστήματα (geographic information system, GIS), από την ηπειρωτική (Βόρεια Ελλάδα), καθώς και από τη νησιωτική χώρα (Κέρκυρα και Λευκάδα) και έγινε προσπάθεια μελέτης της κατανομής των ειδών τους καθώς και ανίχνευσης φλεβοϊών στους συλλεχθέντες φλεβοτόμους, με μοριακές μεθόδους. Τα είδη με την ευρύτερη κατανομή στα νησιά ήταν τα Ph. neglectus, Ph. similis, Ph. tobbi (Ph. perniciosus) και Ph. perfiliewi., ενώ στην ηπειρωτική χώρα ήταν τα Ph. simici, Ph. neglectus και Ph. tobbi (Ph. perniciosus). Σε μία από τις ομάδες θήλεων φλεβοτόμων που συλλέχθηκαν στη θέση Μαραντοχώρι της νήσου Λευκάδας το καλοκαίρι του 2009, ανιχνεύτηκε το γενετικό υλικό ενός νέου φλεβοϊού, που ονομάστηκε ιός Lefkas. Ο νέος αυτός φλεβοϊός, είναι φυλογενετικά συγγενέστερος με τους ιούς του αντιγονικού συμπλέγματος Salehabad, από τους οποίους ωστόσο διαφέρει αρκετά γενετικά (>25% σε επίπεδο νουκλεοτιδίων). Η φυλογενετική ανάλυση που έλαβε χώρα στα πλαίσια της παρούσας διατριβής, έδειξε την ύπαρξη τριών κύριων φυλογενετικών κλάδων φλεβοϊών στην ευρύτερη περιοχή της Ευρώπης, της Ασίας και της Αφρικής, που αντιστοιχούν στα αντιγονικά συμπλέγματα SFN, SFS και Salehabad. Στο αντιγονικό σύμπλεγμα Salehabad περιλαμβάνονται και τα δύο νέα στελέχη φλεβοϊών, ο ιός Αdria και ο ιός Lefkas, τα οποία διαφέρουν αρκετά γενετικά (>40% σε επίπεδο νουκλεοτιδίων) από τους ήδη γνωστούς παθογόνους φλεβοϊούς (SFSV, SFNV και TOSV) της περιοχής αυτής. Ο υψηλός επιπολασμός των φλεβοϊών στην Ελλάδα, ιδιαίτερα στη νησιωτική χώρα, σε συνδυασμό με τον ελάχιστο αριθμό αναφορών κλινικών περιστατικών, φανερώνει ότι ένα σημαντικό ποσοστό των λοιμώξεων από φλεβοϊούς, είτε διαδράμει ήπια ή ασυμπτωματικά, είτε υποδιαγιγνώσκεται. Η ανίχνευση νέων στελεχών φλεβοϊών, ιδιαίτερα αυτών που παρουσιάζουν μεγάλη γενετική διαφορά από τους ήδη γνωστούς παθογόνους ιούς του γένους Phlebovirus, σηματοδοτεί την αναθεώρηση των υπαρχόντων δεδομένων για τους ιούς αυτούς και την ανάγκη σχεδιασμού νέων διαγνωστικών μεθόδων.