Wild birds as a source of selected emerging and re-emerging pathogens: the West Nile Virus example in Greece

Abstract

Since 2010, a major West Nile virus (WNV) outbreak of human infections took place in Greece. From 2010 until 2014 more than 624 laboratory-confirmed cases and 73 deaths were caused by the virus. This thesis reports several studies conducted to investigate possible implication of wild birds during the WNV outbreak in Greece. Moreover, this thesis reports studies conducted to evaluate the application of novel technologies and tools like Geographical Information Systems (GIS) and multiplex diagnostic techniques (microarrays) in wild birds surveillance programs in terms of stratifying surveillance efforts and resources and improving the efficiency of monitoring existing outbreaks and timely recognizing new ones.A WNV lineage 2 strain was molecularly identified and characterised in a Eurasian magpie hunted in Greece in 2010, during a WNV outbreak in humans. This is the first report of detection of WNV RNA in wild birds, and the first direct implication of wild birds to the outbreak. Phylogenetic analysis revealed the highest sequence similarity (>99%) with other WNV lineage 2 strains derived from birds of prey in Austria and Hungary (2004–2009). A serological and molecular surveillance was further conducted on samples of hunter-harvested wild birds prior to and during the outbreak, as well as on samples derived from various areas of mainland Greece.Fourteen positive sera were obtained from birds hunter-harvested up to 8 months prior to the human outbreak. Specific genetic determinants of virulence (His249Pro NS3 mutation, E-glycosylation motif) were recognized in the WNV lineage 2 magpie strain and a nucleotide mismatch was revealed between this strain and a mosquito WNV strain isolated one month earlier in the same area. This is the first report regarding exposure of wild birds to WNV prior to the 2010 outbreak, in Greece. Results provide evidence of the implication of wild birds in a local enzootic cycle that could allow maintenance and amplification of the virus before and during the outbreak. Findings of past exposure of migratory birds to WNV upon their arrival in Greece during autumn migration, suggest avian species with similar migration traits as candidates for the introduction of WNV into Greece. Results showed association of human cases with wild birds’ exposure to the virus; no avian sera were found positive in prefectures not affected by the WNV outbreak. In contrast, positive avian sera were found in every prefecture that human WNV cases occurred in 2011.Another aim of this thesis was to establish a monitoring system with wild birds and reported human cases data using Geographical Information System (GIS). Potential distribution of WNV was modelled by combining wild bird serological surveillance data with environmental factors (e.g. elevation, slope, land use, vegetation density, temperature, precipitation indices, and population density). Local factors including areas of low altitude and proximity to water were important predictors of appearance of both human and wild bird cases (Odds Ratio = 1,001 95%CI = 0,723–1,386). Using GIS analysis, the identified risk factors were applied across Greece identifying the northern part of Greece (Macedonia, Thrace) western Greece and a number of Greek islands as being at highest risk of future outbreaks. The results of the analysis were evaluated and confirmed using the 161 reported human cases of the 2012 outbreak predicting correctly (Odds = 130/31 = 4,194 95%CI = 2,841–6,189) and more areas were identified for potential dispersion in the following years. Our approach verified that WNV risk can be modelled in a fast cost-effective way indicating high risk areas where prevention measures should be implemented in order to reduce the disease incidence.Lastly, tissue samples from hunter-harvested wild birds in Greece as well as selected archived wild avian tissue samples collected in Spain, were used in a general screening study using microarray technology under development. Using this novel technology we were able to detect the presence of genomic material of two viruses (West Nile Virus and Usutu virus) in two samples. These first results are encouraging regarding the application of microarrays in surveillance programs established by public health authorities. Perspectives and difficulties of using these assays as screening tools are discussed.All these findings demonstrate the direct and indirect implication of wild birds in the recent WNV outbreak in Greece and the importance of correlating wildlife and human cases data in application of screening and data analysis tools. Results add value to the need of a One Health approach in establishing monitoring and prevention programs regarding zoonoses. West Nile virus is an excellent example of the interplay of driving forces of pathogen exchange between wild animals, domestic animals and humans. This thesis findings support the view that multidisciplinary co-operation of medical and veterinary authorities and institutes is necessary for monitoring and collecting/analysing data needed for applying the appropriate disease control and prevention measures, protecting in the most successful way Public and Animal Health.

Από το 2010, μία σημαντικά έξαρση ανθρώπινων κρουσμάτων της νόσου του Ιού του Δυτικού Νείλου (ΙΔΝ) έλαβε χώρα στην Ελλάδα. Από το 2010 μέχρι το 2014 πάνω από 624 εργαστηριακά επιβεβαιωμένα κρούσματα και 73 θάνατοι προκλήθηκαν από τον ιό. Η παρούσα διατριβή αναφέρει αρκετές μελέτες που πραγματοποιήθηκαν για να διερευνηθεί πιθανή εμπλοκή των άγριων πτηνών κατά τη διάρκεια της επιδημίας του ΙΔΝ στην Ελλάδα. Επιπλέον, αυτή η διατριβή αναφέρει μελέτες που διεξήχθησαν για την αξιολόγηση της εφαρμογής νέων τεχνολογιών και εργαλείων όπως Γεωγραφικά Συστήματα Πληροφοριών (GIS) και multiplex διαγνωστικές τεχνικές (microarrays) σε προγράμματα επιτήρησης άγριων πτηνών με σκοπό την εξοικονόμηση των προσπαθειών επιτήρησης και των πόρων και τη βελτίωση της αποτελεσματικότητας της παρακολούθησης των υφιστάμενων εστιών και έγκαιρη αναγνώριση νέων.Ένα στέλεχος του ιού του τύπου 2 αναγνωρίστηκε μοριακά και χαρακτηρίστηκε σε μια καρακάξα η οποία και θηρεύτηκε στην Ελλάδα το 2010, κατά τη διάρκεια μιας επιδημίας του ΙΔΝ σε ανθρώπους. Αυτή είναι η πρώτη αναφορά ανίχνευσης RNA του ΙΔΝ σε άγρια πτηνά, και η πρώτη άμεση εμπλοκή των άγριων πτηνών στην έξαρση. Η φυλογενετική ανάλυση έδειξε την μεγαλύτερη ομοιότητα ακολουθίας (> 99%) με άλλα στελέχη του ΙΔΝ που προέρχονται από αρπακτικά πουλιά της Αυστρίας και της Ουγγαρίας (2004-2009). Η ορολογική και μοριακή επιτήρηση επεκτάθηκε περαιτέρω σε δείγματα θηρευμένων αγρίων πτηνών πριν και κατά τη διάρκεια της επιδημίας, καθώς και σε δείγματα που προέρχονται από διάφορες περιοχές της ηπειρωτικής Ελλάδας.Δεκατέσσερις θετικοί οροί ελήφθησαν από πτηνά τα οποία και θηρεύτηκαν μέχρι και 8 μήνες πριν από την έξαρση των ανθρώπινων κρουσμάτων. Ειδικοί γενετικοί παράγοντες παθογένειας (His249Pro NS3 μετάλλαξη, μοτίβο e-γλυκοσυλίωσης) αναγνωρίστηκαν στο στέλεχος του ιού που εντοπίστηκε στη καρακάξα και μία αναντιστοιχία νουκλεοτιδίων αποκαλύφθηκε μεταξύ αυτού του στελέχους και ενός στελέχους που απομονώθηκε από κουνούπι ένα μήνα νωρίτερα στην ίδια περιοχή. Αυτή είναι η πρώτη αναφορά όσον αφορά την έκθεση των αγρίων πτηνών στον ΙΔΝ πριν από το ξέσπασμα του 2010, στην Ελλάδα. Τα αποτελέσματα προσφέρουν αποδείξεις σχετικά με την εμπλοκή των αγρίων πτηνών σε ένα τοπικό ενζωοτικό κύκλο που θα μπορούσε να επιτρέψει τη συντήρηση και ενίσχυση του ιού πριν και κατά τη διάρκεια της επιδημίας. Ευρήματα έκθεσης αποδημητικών πτηνών στον ΙΔΝ κατά την άφιξή τους στην Ελλάδα κατά τη φθινοπωρινή μετανάστευση, προτείνουν είδη πτηνών με παρόμοια μεταναστευτικά χαρακτηριστικά ως υποψήφια για την εισαγωγή του ΙΔΝ στην Ελλάδα. Τα αποτελέσματα έδειξαν συσχέτιση των ανθρώπινων κρουσμάτων με την έκθεση άγριων πτηνών στον ιό καθώς οροί πτηνών δε βρέθηκαν θετικοί σε νομούς που δεν επηρεάζονται από την επιδημία του ιού του ΔΝ. Αντίθετα, θετικοί οροί πτηνών βρέθηκαν σε κάθε νομό όπου αναφέρθηκαν ανθρώπινα κρούσματα της νόσου μέσα στο 2011.Ένας άλλος στόχος της παρούσας διατριβής ήταν η καθιέρωση ενός συστήματος επιτήρησης με δεδομένα άγριων πτηνών και ανθρώπινων κρουσμάτων, με τη χρήση του Συστήματος Γεωγραφικών Πληροφοριών (GIS). Η πιθανή κατανομή του ΙΔΝ εκτιμήθηκε συνδυάζοντας τα δεδομένα ορολογικής επιτήρησης των άγριων πτηνών με περιβαλλοντικούς παράγοντες (π.χ. υψόμετρο, κλίση, χρήση γης, την πυκνότητα της βλάστησης, η θερμοκρασία, δείκτες καθίζηση, και η πυκνότητα του πληθυσμού). Τοπικοί παράγοντες συμπεριλαμβανομένων των περιοχών με χαμηλό υψόμετρο και η εγγύτητα με το νερό ήταν σημαντικοί παράγοντες πρόβλεψης της εμφάνισης του ιού (λόγος πιθανοτήτων = 1,001 95%CI = 0,723-1,386). Χρησιμοποιώντας την ανάλυση GIS, οι εντοπισμένοι παράγοντες κινδύνου εφαρμόζονται σε όλη την Ελλάδα που προσδιορίζουν το βόρειο τμήμα της Ελλάδα (Μακεδονία, Θράκη), τη Δυτική Ελλάδα και μια σειρά από ελληνικά νησιά, όπως είναι σε υψηλότερο κίνδυνο μελλοντικών κρουσμάτων. Τα αποτελέσματα της ανάλυσης αξιολογήθηκαν και επιβεβαιώθηκαν με τη χρήση των 161 ανθρώπινων κρουσμάτων της επιδημίας του 2012 προβλέποντας σωστά (Αποδόσεις = 130/31 = 4,194 95%CI = 2,841-6,189) και παράλληλα περισσότερες περιοχές εντοπίστηκαν ως υψηλού κινδύνου για τη πιθανή διασπορά κατά τα επόμενα έτη. Η προσέγγισή μας επαλήθευσε ότι ο κίνδυνος έκθεσης στον ΙΔΝ μπορεί να απεικονιστεί με ένα γρήγορο και οικονομικά αποδοτικό τρόπο, ο οποίος δείχνει τις περιοχές υψηλού κινδύνου, όπου θα πρέπει να εφαρμοστούν μέτρα πρόληψης, προκειμένου να μειωθεί η συχνότητα εμφάνισης της νόσου.Τέλος, δείγματα ιστού από θηρευμένα άγρια πτηνά στην Ελλάδα, καθώς και επιλεγμένα αρχειακά δείγματα ιστών άγριων πτηνών που συλλέχθηκαν στην Ισπανία, χρησιμοποιήθηκαν σε μια γενική μελέτη διαλογής χρησιμοποιώντας τεχνολογία μικροσυστοιχιών υπό ανάπτυξη. Χρησιμοποιώντας αυτήν την νέα τεχνολογία ήμασταν σε θέση να ανιχνεύσει την παρουσία του γονιδιωματικού υλικού του δύο ιών (ΙΔΝ και ο ιός Usutu) σε δύο δείγματα. Αυτά τα πρώτα αποτελέσματα είναι ενθαρρυντικά όσον αφορά την εφαρμογή των μικροσυστοιχιών σε προγράμματα επιτήρησης που έχουν καθοριστεί από τις αρχές δημόσιας υγείας. Οι προοπτικές και οι δυσκολίες από τη χρήση αυτών των τεχνικών ως εργαλεία διαλογής συζητούνται.Όλα αυτά τα ευρήματα καταδεικνύουν την άμεση και έμμεση επίπτωση των άγριων πτηνών κατά την πρόσφατη επιδημία του ιού του ΔΝ στην Ελλάδα και τη σημασία του συσχετισμού δεδομένων προερχόμενων από την άγρια πανίδα με προερχόμενα από ανθρώπινα κρούσματα κατά την εφαρμογή εργαλείων διαλογής και ανάλυσης. Τα αποτελέσματα προσθέτουν αξία στην ανάγκη μιας One Health προσέγγισης για τη θέσπιση προγραμμάτων παρακολούθησης και πρόληψης όσον αφορά τις ζωοανθρωπονόσους. Ο Ιός του Δυτικού Νείλου είναι ένα εξαιρετικό παράδειγμα της αλληλεπίδρασης των κινητήριων δυνάμεων της ανταλλαγής παθογόνων μεταξύ άγριων ζώων, κατοικίδιων και ανθρώπων. Τα ευρήματα της παρούσας διατριβής ενισχύουν την άποψη ότι η διεπιστημονική συνεργασία των ιατρικών και κτηνιατρικών αρχών και ιδρυμάτων είναι απαραίτητη για την παρακολούθηση και τη συλλογή/ανάλυση των δεδομένων που απαιτείται ώστε να μπορούν να εφαρμοστούν τα κατάλληλα μέτρα ελέγχου και πρόληψης της νόσου, προστατεύοντας με τον πλέον επιτυχημένο τρόπο τη δημόσια υγεία και την υγεία των ζώων.