Μελέτη της δράσης των εξωκυττάριων πρωτεογλυκανών και γλυκοζαμινογλυκανών στις λειτουργίες των κυττάρων του ινοσαρκώματος και διερεύνηση του ρόλου των αυξητικών παραγόντων

Abstract

Fibrosarcoma is a rare malignant tumor originating from fibroblasts. Different cell lines of fibroblastic origin have been shown to have an abundant ECM with a high content and turnover of hyaluronan (HA) and proteoglycans. HA modulates key cancer cell functions through interaction with its CD44 and receptor for hyaluronic acid-mediated motility (RHAMM) receptors. HA was recently found to regulate the migration of fibrosarcoma cells in a manner specifically dependent on its size. It is observed in neonates, in middle-aged and elderly and represents a 10-20% of tumors that occur in childhood. More than half of the patients die within 5 years. The treatment of choice is the excision of the tumor and chemotherapy. The causes of of this cancer type development remain unknown and its diagnosis is usually made by exclusion. The extracellular matrices (ECMs) are complicated structures that surround and support cells within tissues. The ECM acts as a physical scaffold to which tumor cells attach and migrate and thus is crucial for the regulation of cell motility, proliferation, invasion, and metastasis. HA, a glycosaminoglycan, is a ubiquitous component of the extracellular matrix that provides tissue homeostasis and is known to have a fundamental role in maintaining the ECM architecture.High levels of HA reported in tumor cells and peri-tumor stroma are suggested to be strong independent prognostic indicators of poor outcome in breast, ovarian, gastric, and colorectal cancers. In tumor cell microenvironment systems, HA is able to transmit signals originating from the ECM into the cell, and changes in its metabolism have been linked to the promotion of cell motility, adhesion, migration, and metastasis. Considerable evidence indicates that HA mediates these biological processes mostly via specific interactions with its receptors CD44 και RHAMM. CD44 is the best characterized HA receptor and is indicated to be the principal mediator of HA signaling. RHAMM receptor (receptor for hyaluronic acid-mediated motility) is unique among the hyaladherins due to its variable distribution on the cell surface, within the cytoplasm, in the nucleus, or secreted to the ECM. The process of cell adhesion including the molecules that are involved in it play a fundamental role in carcinogenesis. It has been reported that the reduction of adhesion forces between cells and between cell-extracellular matrix allows some cancer cells to separate from each other and detach from an initial tumor site to and to migrate into another (metastasis). An important molecule that is located in adhesion sites, focal adhesion kinase (FAK), induces the adhesive ability of the cells by activating intracellular signaling pathways. The activity of FAK is triggered by various molecules such as Src and ERK kinases that induce its phosphorylation.Moreover, carcinogenesis is a process characterized by deregulated cell proliferation with a simultaneous suppression of apoptosis leading to tumor formation and loss of tissue organization. The canonical Wnt signaling pathway regulates the expression of several fundamental genes that participate in crucial cellular functions such as proliferation, cell differentiation, and survival. The dysfunction of the Wnt cascade is associated with cancer pathogenesis in various tissues. An intracellular protein, β-catenin, is a crucial downstream mediator of the Wnt signaling cascade which can enhance carcinogenic events under pathological conditions. The β-catenin protein has the ability to induce cell proliferation by translocating to the nucleus where it upregulates the transcriptional activity of T-Cell Factor (TCF)/Lymphoid Enhancer Factor (LEF) and the expression of specific target genes, such as cyclin-D1, c-Jun and c-Myc. The aim of this study was to investigate HA/RHAMM interactions in the regulation of cell adhesion and proliferation of HT1080 fibrosarcoma cells. Moreover, we explored potential extracellular and intracellular signaling pathways that may regulate these specific cellular functions. Our ultimate goal was to identify new diagnostic markers for fibrosarcoma as well as target molecules suitable for the treatment of the disease.Initially, we investigated the effect of HA/RHAMM signaling on the ability of HT1080 fibrosarcoma cells to adhere onto fibronectin. Low molecular weight HA (LMWHA) significantly increased (p ≤ 0,01) the adhesion capacity of HT1080 cells, which high molecular weight HA inhibited. The ability of HT1080 RHAMM-deficient cells, but not of CD44-deficient ones, to adhere was significantly decreased (p ≤ 0,001) as compared to control cells. Importantly, the effect of LMWHA on HT1080 cell adhesion was completely attenuated in RHAMM-deficient cells. In contrast, adhesion of RHAMM-deficient cells was not sensitive to high molecular weight HA treatment, which identifies RHAMM as a specific conduit of the LMWHA effect. Western blot and real time-PCR analyses indicated that LMWHA significantly increased RHAMM transcript (p ≤ 0,05) and protein isoform levels (53%, 95 kDa; 37%, 73 kDa) in fibrosarcoma cells. Moreover, Western blot analyses showed that LMWHA in a RHAMM-dependent manner enhanced basal and adhesion-dependent ERK1/2 and focal adhesion kinase (FAK) phosphorylation in HT1080 cells. Utilization of a specific ERK1/2 inhibitor completely inhibited (p ≤ 0,001) LMWHA-dependent adhesion, suggesting that ERK1/2 is a downstream effector of LMWHA/RHAMM signaling. Likewise, the utilization of the specific ERK1 inhibitor resulted in a strong down-regulation of FAK activation in HT1080 cells, which identifies ERK1/2 as a FAK upstream activator.Moreover, we investigated the effect of HA/RHAMM signaling on HT1080 fibrosarcoma cells proliferation. An in vitro proliferation assay showed that both low molecular weight ΗΑ and high molecular weight ΗΑ (HMWHA) significantly increased (p ≤ 0,01 and p ≤ 0,05 respectively) ΗΤ1080 cell proliferation. In order to investigate the direct role of RHAMM on HT1080 cell growth, we utilized siRNA specific for the RHAMM gene. The demonstrated increase of HT1080 cells’ proliferation (p ≤ 0,01) due to LMWHA was completely inhibited in siRHAMM-treated cells as compared with the siRHAMM controls. In an attempt to locate candidate molecules participating in HA/RHAMM signaling pathway, we examined factors regulating the expression of RHAMM. Specifically, with the use of a specific ERK1/2 inhibitor, both the basal and the LMWHA induced proliferation levels were reduced. These results show that ERK1/2 is a mediator of LMWHA/RHAMM signaling. Furthermore, the downregulation of RHAMM led to a significant reduction of β-catenin expression both in mRNA (p ≤ 0,05) and protein levels (p ≤ 0,01). Then, we examined the effect of β-catenin in fibrosarcoma cell proliferation. The downregulation of β-catenin caused a reduction in the basal levels as well as in the LMWHA induced fibrosarcoma cell proliferation. LMWHA altered significantly the β-catenin expression in mRNA (p ≤ 0,01) and protein levels (p ≤ 0,05). The addition of LMWHA resulted in an increase of β-catenin protein expression in the nucleus. Moreover, the downregulation of both β-catenin and RHAMM receptor caused a reduction of c-myc (p ≤ 0,001; p ≤ 0,01) and c-jun (p ≤ 0,001; p = statistically non significant) respectively, which are important modulators of the cell cycle.Our results suggest that RHAMM/HA interaction regulates fibrosarcoma cell adhesion via the activation of FAK and ERK1/2 signaling pathways. The present study also suggests that RHAMM is a novel β-catenin intracellular binding partner, protecting β-catenin from degradation and supporting the nuclear translocation of this key cellular mediator, which results in c-myc activation and enhanced fibrosarcoma cell growth. From the above, therefore, it can be inferred that the RHAMM receptor and LMWHA may pose an investigation field for obtaining useful conclusions which aim at promoting the receptor to a diagnostic marker and both LMWHA and RHAMM as potential target molecules for treating fibrosarcoma.

Το ινοσάρκωμα αποτελεί μια σπάνια μορφή καρκίνου των μαλακών μορίων, που προέρχεται από τους ινοβλάστες. Παρατηρείται σε νεογνά, σε μεσήλικες και ηλικιωμένους και αποτελεί το 10-20 % των όγκων που εμφανίζονται στην παιδική ηλικία. Περισσότεροι από τους μισούς ασθενείς πεθαίνουν σε διάστημα 5 ετών. Η θεραπεία επιλογής είναι αφαίρεση του όγκου και χημειοθεραπεία. Η κυτταρική παθοφυσιολογία του όγκου παραμένει σε μεγάλο βαθμό άγνωστη και η διάγνωσή του, αρκετές φορές γίνεται συνήθως με τον αποκλεισμό των άλλων τύπων σαρκώματος.Η εξωκυττάρια θεμέλια ουσία είναι μια σύνθετη δομική οντότητα, η οποία περιβάλλει και υποστηρίζει τα κύτταρα που απαρτίζουν τους ιστούς. Τα κύρια δομικά συστατικά της είναι το κολλαγόνο, οι γλυκοπρωτεΐνες, οι πρωτεογλυκάνες (PGs) και οι γλυκοζαμινογλυκάνες (GAGs). Η εξωκυττάρια θεμέλια ουσία αποτελεί ένα φυσικό σκελετό για την κυτταρική προσκόλληση και είναι εξαιρετικά σημαντική για τη φυσιολογική λειτουργία των κυττάρων, ρυθμίζοντας τον πολλαπλασιασμό, τη μετανάστευση και την διαφοροποίηση τους. Το υαλουρονικό οξύ (ΗΑ), μια μη-θειωμένη γλυκοζαμινογλυκάνη υψηλού μοριακού βάρους, αποτελεί ένα από τα βασικά συστατικά της εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας (ECM) και διατηρεί την ομοιόσταση των ιστών.Υψηλά επίπεδα HA που έχουν βρεθεί σε καρκινικές κυτταρικές σειρές έχει προταθεί ότι αποτελούν σημαντικούς προγνωστικούς δείκτες μειωμένης επιβίωσης σε καρκίνους του μαστού, των ωοθηκών και του παχέος εντέρου. Στο μικροπεριβάλλον των καρκινικών κυττάρων, το HA μεταδίδει σήματα από την εξωκυττάρια θεμέλια ουσία προς το εσωτερικό του κυττάρου και αλλαγές στο μεταβολισμό του οδηγούν σε αύξηση της κυτταρικής κινητικότητας, της προσκόλλησης, της μετανάστευσης και της μετάστασης. Σημαντικά ευρήματα καταδεικνύουν ότι το HA ρυθμίζει αυτές τις κυτταρικές λειτουργίες κυρίως μέσω της αλληλεπίδρασής του με τους ειδικούς υποδοχείς του, CD44 και RHAMM.Ο CD44 είναι ο καλύτερα χαρακτηρισμένος υποδοχέας του HA και έχει δειχθεί ότι είναι ο κύριος ρυθμιστής του. Ο RHAMM (receptor for hyaluronic acid-mediated motility) διαφέρει απ’ τους υπόλοιπους υποδοχείς του HA λόγω του ότι εντοπίζεται στην κυτταρική μεμβράνη, στο κυτταρόπλασμα, στο πυρήνα καθώς επίσης και στην εξωκυττάρια θεμέλια ουσία ως εκκρινόμενη πρωτεΐνη. H διαδικασία της κυτταρικής προσκόλλησης, και τα εμπλεκόμενα σε αυτή μόρια, διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στη διαδικασία της καρκινογένεσης. Έχει αναφερθεί ότι η ελάττωση των προσκολλητικών δυνάμεων μεταξύ των κυττάρων και μεταξύ κυττάρου-εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας επιτρέπει σε μερικά καρκινικά κύτταρα να αποχωριστούν μεταξύ τους και να αποκολληθούν από την αρχική καρκινική εστία και να μεταναστεύσουν σε άλλο όργανο. Στα σημεία κυτταρικής προσκόλλησης εντοπίζεται η κινάση εστιακής προσκόλλησης (FAK), η οποία επάγει την προσκολλητική ικανότητα των κυττάρων ενεργοποιώντας ενδοκυττάρια σηματοδοτικά μονοπάτια. Η δράση της FAK ενεργοποιείται από διάφορα μόρια που επάγουν τη φωσφωρυλίωσή της, κάποια απ’ τα οποία είναι οι κινάσες Src και ERK. Η καρκινογένεση αποτελεί μια κυτταρική λειτουργία που χαρακτηρίζεται από τη διαταραχή του κυτταρικού πολλαπλασιασμού με την ταυτόχρονη καταστολή της απόπτωσης με αποτέλεσμα το σχηματισμό όγκων. Το σηματοδοτικό μονοπάτι Wnt είναι γνωστό ότι ρυθμίζει την έκφραση σημαντικών γονιδίων που συμμετέχουν σε βασικές κυτταρικές λειτουργίες όπως είναι η κυτταρική διαφοροποίηση και ο κυτταρικός πολλαπλασιασμός. Έχει δειχθεί ότι η διαταραχή της λειτουργίας του Wnt σηματοδοτικού μονοπατιού έχει συσχετιστεί με την εμφάνιση καρκίνου σε διάφορους κυτταρικούς τύπους. Η β-catenin είναι μια πρωτεΐνη με πολλές λειτουργίες που συμμετέχει στο Wnt μονοπάτι διεγείροντας την κυτταρική αύξηση και ρυθμίζοντας λειτουργίες που σχετίζονται με την ανάπτυξη και την καρκινογένεση. Η πρωτεΐνη αυτή έχει την ικανότητα να επάγει τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό με τη μετατόπισή της στον πυρήνα. Ο ρόλος της εκεί είναι να ρυθμίζει τη μεταγραφική ικανότητα των T-Cell Factor (TCF)/Lymphoid Enhancer Factor (LEF) και πιο συγκεκριμένα να ενεργοποιεί γονίδια όπως η cyclin-D1, c-jun, c-myc. Σκοπός της παρούσας διατριβής ήταν η μελέτη της δράσης της HA/RHAMM αλληλεπίδρασης σε δύο βασικές κυτταρικές λειτουργίες, αυτές της προσκόλλησης και του πολλαπλασιασμού των HT1080 κυττάρων του ινοσαρκώματος. Επίσης βασιζόμενοι στη προϋπάρχουσα βιβλιογραφία, διερευνήσαμε πιθανά εξωκυττάρια και ενδοκυττάρια μονοπάτια σηματοδότησης που επιδρούν στη ρύθμιση των συγκεκριμένων κυτταρικών λειτουργιών. Απώτερος στόχος μας ήταν ο εντοπισμός νέων διαγνωστικών δεικτών για το ινοσάρκωμα καθώς και μορίων-στόχους κατάλληλων για τη θεραπευτική αντιμετώπισή του. Πιο συγκεκριμένα, στη συγκεκριμένη μελέτη εξετάσαμε τη δράση της HA/RHAMM σηματοδότησης στην ικανότητα προσκόλλησης των HT1080 κυττάρων ινοσαρκώματος πάνω σε υπόστρωμα ινονεκτίνης. Το χαμηλού μοριακού βάρους HA (LMWHA), αύξησε σημαντικά την προσκολλητική ικανότητα των HT1080 κυττάρων, ενώ το υψηλού μοριακού βάρους HA τη μείωσε. Η ικανότητα προσκόλλησης των κυττάρων στα οποία είχε ανασταλεί η έκφραση του RHAMM, μειώθηκε σημαντικά (p ≤ 0,001), ενώ σε αυτά που είχε ανασταλεί η έκφραση του CD44 δεν διαπιστώθηκε αλλαγή σε σχέση με τα κύτταρα ελέγχου. Σημαντικό είναι το γεγονός ότι η επίδραση του LMWHA στην κυτταρική προσκόλληση των ΗΤ1080 κυττάρων καταργήθηκε στα κύτταρα τα οποία είχε ανασταλεί η έκφραση του RHAMM. Αντιθέτως, τα ίδια κύτταρα δεν έδειξαν καμία αλλαγή με την προσθήκη του υψηλού μοριακού βάρους HA, γεγονός που καταδεικνύει τον RHAMM σαν ένα εξειδικευμένο και απαραίτητο μόριο για τη δράση του LMWHA. Οι τεχνικές της ανοσοαποτύπωσης κατά Western και της PCR έδειξαν ότι το LMWHA αυξάνει σημαντικά την mRNA έκφραση του RHAMM (p ≤ 0,05) καθώς και τα επίπεδα πρωτεϊνικών ισομορφών του RHAMM (53% 45kDa, 95 kDa 37%, 73 kDa) σε κύτταρα ινοσαρκώματος. Επιπλέον, η ανοσοαποτύπωση κατά Western έδειξε ότι το LMWHA μέσω του RHAMM ενισχύει τόσο τα βασικά επίπεδα κυτταρικής προσκόλλησης όσο και τα επίπεδα φωσφορυλίωσης της ERK1/2 και της κινάσης της προσκόλλησης (FAK). Με χρήση ενός ειδικού αναστολέα της ERK1/2 προέκυψε πλήρης αναστολή (p ≤ 0,001) της δράσης του LMWHA στην προσκόλληση των κυττάρων, γεγονός που αποδεικνύει ότι η ERK1/2 αποτελεί έναν ρυθμιστή της LMWHA/RHAMM σηματοδότησης. Αντίστοιχα, με τη χρήση ενός ειδικού αναστολέα της ERK1/2 προκλήθηκε σημαντική μείωση της ενεργοποίησης της FAK γεγονός που αποδεικνύει ότι η ERK1/2 αποτελεί έναν ενεργοποιητή της FAK.Στην συνέχεια εξετάστηκε η επίδραση της σηματοδότησης του ΗΑ, μέσω του RHAMM υποδοχέα του, στον πολλαπλασιασμό κυττάρων του ινοσαρκώματος. Μία in vitro δοκιμή πολλαπλασιασμού έδειξε ότι τόσο το χαμηλού μοριακού βάρους ΗΑ (LMWHA) όσο και το υψηλού μοριακού βάρους ΗΑ (HMWHA) αύξησαν σημαντικά (p ≤ 0,01 και p ≤ 0,05 αντίστοιχα) τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων ΗΤ1080. Προκειμένου να μελετηθεί ο άμεσος ρόλος του RHAMM στον επαγόμενο από το ΗΑ πολλαπλασιασμό των ΗΤ1080 κυττάρων, έγινε αναστολή της έκφρασης του RHAMM με χρήση RNA παρεμβολής (siRNA). Κύτταρα μετασχηματισμένα με siRHAMM έδειξαν σημαντική μείωση στο βασικό (p ≤ 0,01) και στον επαγόμενο από το LMWHA (p ≤ 0,001) ρυθμό ανάπτυξης. Στην προσπάθεια εντοπισμού υποψήφιων μορίων που συμμετέχουν στο ΗΑ/RHAMM μονοπάτι σηματοδότησης, εξετάστηκαν παράγοντες που ρυθμίζουν την έκφραση του RHAMM. Πιο συγκεκριμένα, με χρήση ενός ειδικού αναστολέα της ERK1/2 μειώθηκαν τόσο τα βασικά επίπεδα καθώς και ο επαγόμενος από το LMWHA πολλαπλασιασμός των κυττάρων του ινοσαρκώματος, γεγονός που αποδεικνύει ότι η ERK1/2 αποτελεί έναν ρυθμιστή της LMWHA/RHAMM σηματοδότησης. Στη συνέχεια, μετά από αναστολή του RHAMM μειώθηκε σημαντικά η έκφραση της β-catenin τόσο σε επίπεδο mRNA (p ≤ 0,05) όσο και σε επίπεδο πρωτεΐνης (p ≤ 0,01). Έπειτα, εξετάστηκε η δράση της στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων του ινοσαρκώματος. Η αναστολή του γονιδίου της β-catenin οδήγησε σε αναμενόμενη μείωση τόσο των βασικών επιπέδων αλλά και του επαγόμενου από το LMWHA κυτταρικού πολλαπλασιασμού. Το LMWHA άλλαξε σημαντικά την έκφραση της β-catenin τόσο σε επίπεδο mRNA (p ≤ 0,01) όσο και σε επίπεδο πρωτεΐνης (p ≤ 0,05). Πιο συγκεκριμένα, η προσθήκη LMWHA οδήγησε σε αύξηση των επιπέδων της β-catenin που εντοπίζεται στον πυρήνα. Ακόμη, μετά από αναστολή της έκφρασης της β-catenin καθώς και του RHAMM υποδοχέα μειώθηκε σημαντικά η έκφραση των γονιδίων c-myc (p ≤ 0,001; p ≤ 0,01) και c-jun (p ≤ 0,001; p = στατιστικά μη σημαντικό) αντίστοιχα, τα οποία είναι υπεύθυνα για τη ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου.Με την παρούσα μελέτη διαπιστώθηκε ότι η RHAMM/HA αλληλεπίδραση ρυθμίζει την κυτταρική προσκόλληση του ινοσαρκώματος μέσω της ενεργοποίησης των FAK και ERK1/2 μονοπατιών σηματοδότησης. Επίσης, τα δεδομένα που προκύπτουν αναδεικνύουν για πρώτη φορά την ύπαρξη μιας ενδοκυττάριας αλληλεπίδρασης του RHAMM με τη β-catenin η οποία οδηγεί στη ρύθμιση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων του ινοσαρκώματος μέσω της ενεργοποίησης του μεταγραφικού παράγοντα c-myc. Από τα παραπάνω λοιπόν, συνάγεται ότι ο RHAMM υποδοχέας και το LMWHA μπορούν να αποτελέσουν περαιτέρω πεδίο έρευνας για την άντληση χρήσιμων συμπερασμάτων που θα στοχεύουν στην ανάδειξη του υποδοχέα σε διαγνωστικό δείκτη και το LMWHA μαζί με RHAMM υποδοχέα ως πιθανά μόρια-στόχοι για τη θεραπευτική αντιμετώπιση του ινοσαρκώματος.