Διερεύνηση λοιμώξεων από πηκτάση-αρνητικά στελέχη του γένους Staphylococcus σε ασθενείς με προσθετικά υλικά

Abstract

Coagulase-negative staphylococci (CNS), especially Staphylococcus epidermidis and S. haemolyticus, have emerged as opportunistic pathogens in patients with low immune response or indwelling medical devices. In this study, bloodstream (BSIs) and prosthetic-device associated infections (PDAIs) CNS isolates were compared in terms of biofilm formation, antimicrobial resistance, clonal distribution, adhesin and toxin genes carriage. A collection of 226 CNS (168 S. epidermidis and 58 S. haemolyticus) from BSIs (100) and PDAIs (126) of different patients in the Patras tertiary-care University General Hospital (UGHP) and Pentelis Paediatric Hospital in Athens (PPHA), was tested for biofilm formation, antimicrobial susceptibility, mecA, ica operon, adhesin (aap, bap, fnbA, atlE, fbe) and toxin (tst, sea, seb, sec, sed) genes carriage. All CNS were classified into pulsotypes by PFGE, whereas S. epidermidis strains were assigned to sequence types by MLST. 106 isolates (46.9%) produced biofilm, whereas 150 (66.4%) carried ica operon. Most isolates carried mecA and were multidrug resistant (90.7%). The adhesin encoding genes aap, fnbA and bap were identified in 40.3%, 35.8% and 20.4% of the population, respectively. Genes encoding AtlE and Fbe were found in 88.1% and 81% of S. epidermidis isolates, respectively. CNS recovered from BSIs prevailed in biofilm formation, resistance to antimicrobials and mecA carriage as compared to isolates derived from PDAIs. CNS from PDAIs carried more frequently aap and bap genes. No statistically significant difference in toxin genes carriage was identified. Even though PFGE showed genetic diversity, especially among S. epidermidis, analysis of representative strains from the main PFGE types by MLST, revealed three major clones (ST2, ST5, ST16). A clonal relationship was found concerning antimicrobial susceptibility, ica and aap gene carriage, reinforcing the aspect of clonal expansion in hospital settings. Pathogenesis of BSIs is associated with biofilm formation and high-level antimicrobial resistance, whereas PDAIs are related to the adhesion capability of CNS. In the second part of this study we analyzed a collection of S. lugdunensis isolates recovered from different inpatients hospitalized in UGHP (37 isolates) and PPHA (one isolate) during a six-year period (2008-2013). A collection of 38 S. lugdunensis was tested for biofilm formation, antimicrobial susceptibility, clonal distribution, virulence factors (ica operon, fbl, atlL, vwbl, slush) and antibiotic resistance genes (mecA, ermC) carriage. The majority (22) was isolated from skin and soft tissue infections (SSTIs), nine from deep-sited infections (DSIs), including three bacteraemias and seven from PDAIs. All isolates were oxacillin-susceptible, mecA-negative and fbl-positive. The higher resistance rate was detected for ampicillin (50%), followed by erythromycin and clindamycin (18.4%). Fourteen isolates (36.8%) produced biofilm, 26 carried ica operon, but no relation between ica carriage and biofilm formation was identified. Biofilm formation was more frequent in isolates recovered from PDAIs. Thirty six strains (94.7%) carried atlL, 31 (81.6%) vwbl, whereas, slush was detected in fifteen (39.5%). PFGE revealed low level of genetic diversity: strains were classified into seven pulsotypes, with two major clones C and D including 22 and nine strains, respectively. Type C strains, recovered from all infection sites, prevailed in biofilm formation and ermC carriage, whereas, type D strains, associated with SSTIs and DSIs, carried more frequently vwbl, slush or both genes. Despite susceptibility to antimicrobials, clonal expansion and carriage of virulence factors combined with biofilm-producing ability render this species an important pathogen that should not be ignored.

Σκοπός της εργασίας ήταν η επιδημιολογική μελέτη λοιμώξεων από πηκτάση-αρνητικούς σταφυλοκόκκους (CNS) σε ασθενείς με προσθετικά υλικά και η σύγκριση με στελέχη από βακτηριαιμίες. Μελετήθηκαν 168 Staphylococcus epidermidis και 58 S. haemolyticus από βακτηριαιμίες (BSIs, 100 στελέχη) και εντοπισμένες λοιμώξεις σχετιζόμενες με εφαρμογή προσθετικών υλικών (PDAIs, 126 στελέχη) από ασθενείς του Πανεπιστημιακού Γενικού Νοσοκομείου Πατρών (ΠΓΝΠ) και του Νοσοκομείου Παίδων Πεντέλης (ΝΠΠ). Η πλειοψηφία των στελεχών (89.8%) ήταν ανθεκτικά στην methicillin (MR-CNS) και πολυανθεκτικά (90.7%). Βιομεμβράνη συνέθεταν 106/226 στελέχη, ενώ 208 παρήγαγαν β-λακταμάση. Τα γονίδια σύνθεσης προσκολλητινών aap, fnbA και bap βρέθηκαν σε συχνότητα 40.3%, 35.8% και 20.4% αντίστοιχα. Οι S. epidermidis έφεραν τα γονίδια atlE και fbe σε ποσοστά 88.1% και 81%, αντίστοιχα. Από τα γονίδια σύνθεσης τοξινών, συχνότερο ήταν το γονίδιο της τοξίνης τοξικής καταπληξίας tst (8.4%) ενώ τα γονίδια που κωδικοποιούν τις εντεροτοξίνες sea, sec βρέθηκαν σε μικρό ποσοστό (5.3% και 3.1% αντίστοιχα). Κανένα στέλεχος δεν έφερε τα γονίδια σύνθεσης των εντεροτοξινών seb και sed. Ο πληθυσμός S. epidermidis έδειξε μεγάλη γενετική ποικιλομορφία, με 67 PFGE τύπους, μεταξύ των οποίων δύο κύριοι (a, b) με 50 και 36 στελέχη αντίστοιχα. Έλεγχος με MLST ανέδειξε τρεις κύριους κλώνους (ST2, ST5 και ST16) που ανήκαν στο ίδιο κλωνικό σύμπλεγμα (Clonal Complex 2). Τα στελέχη του PFGE τύπου a παρουσίασαν υψηλότερα ποσοστά αντοχής στα αντιμικροβιακά clindamycin, ciprofloxacin, fusidic acid, SXT και στις αμινογλυκοσίδες, ενώ τα στελέχη του τύπου b έφεραν συχνότερα το γονίδιο aap. Τα στελέχη S. haemolyticus παρουσίασαν μικρότερη ποικιλομορφία, με έναν κύριο PFGE τύπο (h), που περιελάμβανε 44/58 στελέχη (75.9% του πληθυσμού). Τα στελέχη CNS από BSIs ήταν συχνότερα ανθεκτικά στην methicillin και στα υπόλοιπα αντιμικροβιακά , ενώ υπερείχαν και στην παραγωγή biofilm. Αντιθέτως, οι CNS από PDAIs έφεραν συχνότερα τα γονίδια των προσκολλητινών aap και bap.Επιπλέον μελετήθηκε ένας πληθυσμός S. lugdunensis από το ΠΓΝΠ (37 στελέχη) και το ΝΠΠ (1 στέλεχος). Είκοσι δύο S. lugdunensis απομονώθηκαν από ασθενείς με λοιμώξεις δέρματος και μαλακών μορίων (Skin and Soft Tissue Infections: SSTIs), εννέα από εν τω βάθει λοιμώξεις (Deep Sited Infections: DSIs), συμπεριλαμβανομένων τριών στελεχών από ασθενείς με βακτηριαιμία, και επτά από λοιμώξεις σχετιζόμενες με προσθετικά υλικά (PDAIs). Όλα τα στελέχη ήταν ευαίσθητα στην methicillin (MS-CNS), στις αμινογλυκοσίδες (kanamycin, gentamicin), καθώς και στα: ciprofloxacin, rifampicin, teicoplanin, vancomycin, linezolid και daptomycin, ενώ τέσσερα ήταν πολυανθεκτικά. Οι S. lugdunensis έδειξαν μικρή γενετική ποικιλομορφία με επτά κλώνους και δύο κύριους PFGE τύπους (C και D), με 22 και εννέα στελέχη αντίστοιχα. 26 στελέχη έφεραν το οπερόνιο ica, ενώ 14 ήταν biofilm-θετικά. Δεν παρατηρήθηκε συσχέτιση της παρουσίας του ica με κάποιο κλώνο ή την παραγωγή βιομεμβράνης. Οι S. lugdunensis από PDAIs ήταν συχνότερα biofilm-θετικοί σε σχέση με τα στελέχη από SSTIs και DSIs, ενώ ο κύριος κλώνος C παρήγαγε biofilm σε μεγαλύτερο ποσοστό από τον D, δεύτερο σε συχνότητα κλώνο. Το γονίδιο fbl ανιχνεύθηκε σε όλα τα στελέχη S. lugdunensis, επιβεβαιώνοντας την φαινοτυπική ταυτοποίηση σε επίπεδο είδους. Ο επόμενος κατά σειρά συχνότητας παράγοντας παθογένειας ήταν το γονίδιο atlL (94.7%). Ακολουθούν οι παράγοντες vwbl και slush, σε 31 (81.6%) και 15 (39.5%) S. lugdunensis, αντίστοιχα. Τα στελέχη από DSIs έφεραν σε μεγαλύτερο ποσοστό τα γονίδια vwbl και slush. Ο κλώνος C υπερείχε στην παρουσία του ermC, ενώ τα στελέχη του κλώνου D έφεραν σε μεγαλύτερο ποσοστό τα γονίδια vwbl και slush.