Εφαρμογή μοριακών μεθόδων ανίχνευσης μηχανισμών αντοχής σε αντιβιοτικά, παραγωγής τοξινών και συσχετισμός κλώνων σε κλινικά στελέχη Staphylococcus aureus

Abstract

The purpose of this study was to establish the clonality and evolution of CAMRSA (Community-acquired MRSA, CA-MRSA) and HA-MRSA (Hospital acquired MRSA, HA-MRSA), as well as the epidemiology of MRSA (Methicillin- Resistant S. aureus, MRSA) infections, during 2001-2006. In total 1922 Staphylococcus aureus strains were collected from patients with different pathologies admitted at the University Hospital of Patras. Among them 757 (39.4%) strains were MRSA. The prevalence of MRSA infections rose from 23% in 2001 to 49% in 2006. MRSA is a major problem worldwide in the nosocomial setting and the community. During 2001-2006 CA-MRSA isolated with an increasing rate from 3% in 2001 to 37% in 2006, while HA-MRSA decreased from 20% in 2001 to 12% in 2006. The epidemiological study of MRSA infections was based on PFGE, the “gold standard” of typing methods and hybridization with specific DNA probes. However, for the full characterization of a strain it is recommended the application of the multilocus sequence typing (MLST), since it is a highly discriminatory method and permits to compare the results from different laboratories. MLST represents a major advance since it relates organisms on the basis of the nucleotide sequences of ~450 bp internal fragments of seven conserved housekeeping genes resulting to the determination of Sequence Types (ST) and Clonal Complexes (CC). MRSA of our collection belonged to seven ST/SCCmec clones (ST80/IV, ST5/IV, ST377/V, ST30/IVvar, ST239/III, ST225/NT and ST217/NT) and five Clonal Complexes. Most CA-MRSA isolates belonged to ST80/IV clone and a small percentage to the newly described clone, ST377/V, while HA-MRSA strains were mainly characterized as ST239/III and ST30/IVvar clones. PVL is a bicomponent toxin associated with skin and soft tissue infections, but also with necrotizing pneumonia, especially in children. In total 74% of MRSA were positive for the PVL genes rising from 33% in 2001 to 88% in 2006. PVL-positive MRSA strains belonged to ST80/IV and ST377/V clones. Most PVL-positive CAMRSA isolated from skin and soft tissue infections, while PVL-positive HA-MRSA isolated from surgical wounds, especially when prosthetic devices were used. In one patient acute staphylococcal osteomyelitis (AO) was diagnosed, due to MRSA carrying the PVL genes. This is the first description of CA-MRSA producing PVL as causative agents of AO suggesting that PVL-positive S. aureus can be isolated from patients with invasive musculo-skeletal infections, including acute childhood osteomyelitis, as well as among patient with skin and soft-tissue infections. Staphylococcal enterotoxins, enterotoxin-like superantigens (enterotoxin gene operon, egc) and the toxic shock syndrome toxin-1 that belong to the pyrogenic toxin superantigens (PTSAgs) are considered major virulence factors. The genotype tst/egc belonged only to ST30/IV clone and never coexisted with the PVL genes. Other combinations of genes were also detected belonging to clones ST80/IV and ST239/III, suggesting the horizontal transfer of those genes. On the contrary, the PVL genes were detected only in ST80/IV and ST377/V clones, meaning a more specific way of spread. A real-time PCR assay was developed for the quantification of tst gene in methicillin-resistant S. aureus using SYBR Green I (SG) chemistry, which is an easy and cost-effective approach to real-time, since it does not require the design of sequence specific probes and new primers. By the developed method of absolute quantification the results were reproducible and constant, meaning that the assay can be applied in the routine laboratory. The statistically significant difference of tst gene expression among strains associated with SSTIs, suggests that such strains may be the cause of TSS among patients. For the calculation of expression ratios in the relative quantification we applied two mathematical models (2-ΔΔCt and Pfaffl). Comparing ratios derived from the two mathematical methods we found variations, allowing us to suggest the use of the Pfaffl model as the more precise and reliable method.

Σκοπός της παρούσας ερευνητικής εργασίας ήταν η επιδημιολογική μελέτη των σταφυλοκοκκικών λοιμώξεων και κυρίως των λοιμώξεων από MRSA, τόσο στο ενδονοσοκομειακό περιβάλλον, όσο και στην κοινότητα, το διάστημα 2001-2006. Κατά τη διάρκεια της μελέτης, συλλέχθηκαν συνολικά 1922 στελέχη Staphylococcus aureus από όλες τις κλινικές και από διαφορετικούς ασθενείς στο Πανεπιστημιακό Γενικό Νοσοκομείο Πατρών (ΠΓΝΠ). Στη συνέχεια τα στελέχη ελέγχθηκαν για την παραγωγή της πρωτεΐνης PBP2α και την ύπαρξη του γονιδίου mecA για τον προσδιορισμό των ανθεκτικών στη methicillin στελεχών S. aureus (Methicillin-Resistant S. aureus, MRSA). Από το σύνολο των 1922 S. aureus, τα 757 (39.4%) χαρακτηρίσθηκαν ως MRSA. Γενικά, παρατηρήθηκε αύξηση του αριθμού των λοιμώξεων από S. aureus, με παράλληλη αύξηση του ποσοστού των MRSA λοιμώξεων, από 23% το 2001 στο 49% το 2006. Οι MRSA αποτελούν σοβαρό πρόβλημα για τα νοσοκομεία, αλλά και γενικότερα σε όλο το πληθυσμό, καθώς απομονώνονται με αυξανόμενη συχνότητα από την κοινότητα. Στο διάστημα που καλύπτει η παρούσα μελέτη, 2001-2006, το ποσοστό των στελεχών που απομονώθηκαν από την κοινότητα (Community-acquired MRSA, CA-MRSA) αυξήθηκε από 3% το 2001, σε 37% το 2006, ενώ εκείνο των ενδονοσοκομειακών στελεχών (Hospital-acquired MRSA, HA-MRSA), είναι ενθαρρυντικό ότι μειώθηκε από 20% το 2001, στο 12% το 2006. Για την επιδημιολογική μελέτη των λοιμώξεων που οφείλονται σε MRSA στελέχη, μέθοδος αναφοράς είναι η PFGE, κυρίως σε συνδυασμό και με υβριδισμό του χρωμοσωμικού DNA με ειδικούς ανιχνευτές. Οι μέθοδοι αυτές παρουσιάζουν δυσκολία στη σύγκριση των κλώνων μεταξύ των χωρών και έτσι αναπτύχθηκε η MLST, που βασίζεται στη εύρεση της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας επτά συντηρημένων γονιδίων και επιτρέπει τον προσδιορισμό των κλωνικών συμπλεγμάτων (Clonal Complex, CC) με δυνατότητα άμεσης ταυτοποίησής τους. Τα MRSA που απομονώθηκαν κατατάχθηκαν σε επτά ST/SCCmec κλώνους, τους ST80/IV, ST5/IV, ST377/V, ST30/IVvar, ST239/III, ST225/NT και ST217/NT και πέντε κλωνικά συμπλέγματα (Πίνακας 46). Στα CA-MRSA επικρατεί ο ST80/IV, με μικρό ποσοστό να ανήκει και στον πρόσφατο τύπο ST377/V, ενώ στα HA-MRSA απαντώνται κυρίως οι ST239/III και ST30/IVvar. Η PVL είναι μια τοξίνη που καταστρέφει τα λευκοκύτταρα ανοίγοντας πόρους στην κυτταρική τους μεμβράνη, προκαλεί νέκρωση ιστών και νεκρωτική πνευμονία, κυρίως σε μικρά παιδιά, και κωδικοποιείται από τα γονίδια lukS-PV και lukF-PV. Το 74% των MRSA που μελετήθηκαν το διάστημα 2001-2006, έφεραν τα γονίδια αυτά, καταγράφοντας αύξηση από 33% το 2001, σε 88% το 2006. Τα PVL-θετικά MRSA ανήκουν στους κλώνους ST80/IV και ST377/V. Τα περισσότερα PVL-θετικά CAMRSA της μελέτης μας απομονώθηκαν από λοιμώξεις δέρματος και μαλακών μορίων, ενώ τα PVL-θετικά HA-MRSA προέρχονταν από χειρουργικά τραύματα, κυρίως σε περιπτώσεις χρήσης προσθετικών υλικών. Ένα PVL-θετικό στέλεχος, που απομονώθηκε από αιματοκαλλιέργεια, προερχόταν από οστεομυελίτιδα. Πρόκειται για πρώτη αναφορά περιστατικών οξείας οστεομυελίτιδας, με αίτιο στελέχη CAMRSA και MSSA που παράγουν PVL. Φαίνεται ότι η παρουσία των γονιδίων lukS-PV και lukF-PV συνδέεται κυρίως με λοιμώξεις που προκύπτουν δευτερογενώς σε τραύματα και επιπολής λοιμώξεις δέρματος και μαλακών μορίων, ενώ η απομόνωση PVL-θετικού στελέχους από οστεομυελίτιδα αποτελεί ένδειξη για την εμπλοκή της τοξίνης αυτής και στη παθογένεια εν τω βάθει λοιμώξεων. Εκτός από την PVL, σημαντικοί λοιμογόνοι παράγοντες και αίτια σοβαρών κλινικών συνδρόμων στον άνθρωπο θεωρούνται και οι τοξίνες της οικογένειας των υπεραντιγόνων, όπως η τοξίνη του συνδρόμου τοξικής καταπληξίας (TSST-1) και οι εντεροτοξίνες (SEs). Το γονίδιο tst κωδικοποιεί την παραγωγή της TSST-1, ενώ το οπερόνιο egc (enterotoxin gene cluster) την έκφραση πρωτεϊνών που μοιάζουν στη δομή και αλληλουχία με τις εντεροτοξίνες. Στα MRSA της συλλογής μας, τα γονίδια tst και egc2 ανιχνεύθηκαν μόνο στον κλώνο ST30/IV και δε βρέθηκαν ποτέ να συνυπάρχουν με τα γονίδια της PVL. Ανιχνεύθηκαν και συνδυασμοί των γονιδίων tst και του οπερονίου egc στους κλώνους ST80/IV και ST239/III, που σημαίνει ότι τα γονίδια αυτά διασπείρονται με οριζόντια μεταφορά, ενώ τα γονίδια lukS-PV και lukFPV, που εντοπίστηκαν αποκλειστικά στους κλώνους ST80/IV ST377/V και χωρίς να συνυπάρχουν με γονίδια υπεραντιγόνων, φαίνεται ότι μεταφέρονται πιο ειδικά. Προϊόν της παρούσας ερευνητικής εργασίας ήταν η ανάπτυξη μεθοδολογίας για την ποσοτικοποίηση με αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης πραγματικού χρόνου, του γονιδίου tst σε στελέχη S. aureus που ήταν ανθεκτικά στη methicillin, κατατάσσονταν σε διαφορετικούς κλώνους και έφεραν ποικίλα γονίδια τοξινών. Για τη σήμανση και παρακολούθηση των προϊόντων χρησιμοποιήθηκε το SYBR Green I (SG), που είναι μη ειδικός τρόπος σήμανσης. Η χρήση του SYBR Green I κάνει τη μέθοδο εύχρηστη, αφού μπορεί η χρωστική να προστεθεί απλά στο υπόλοιπο μίγμα της αντίδρασης και φθηνή, επειδή δε χρειάζεται να σχεδιαστούν καινούριοι, ειδικοί εκκινητές. Οι αντιδράσεις απόλυτης ποσοτικοποίησης, που πραγματοποιήθηκαν με τη συγκεκριμένη μέθοδο, είχαν υψηλή απόδοση (2.04) και τα αποτελέσματα ήταν συνεχή και επαναλαμβανόμενα, γεγονός που σημαίνει ότι μπορεί να εφαρμοσθεί στη ρουτίνα του κλινικού εργαστηρίου για τη γρήγορη ανίχνευση και ποσοτικοποίηση του γονιδίου tst στα κλινικά στελέχη. Επί πλέον αποδείχθηκε με τη στατιστική ανάλυση, ότι στελέχη που απομονώθηκαν από λοιμώξεις μαλακών μορίων συνέθεταν υψηλότερα ποσά tst. Για τον υπολογισμό των λόγων έκφρασης του γονιδίου tst, στη σχετική ποσοτικοποίηση εφαρμόσθηκαν δυο μαθηματικά μοντέλα (2-ΔΔCt και Pfaffl). Συγκρίνοντας τα αποτελέσματα από τους δυο διαφορετικούς τρόπους υπολογισμού, βρέθηκαν διαφορές στα επίπεδα έκφρασης ίδιων στελεχών και καταλήξαμε στο συμπέρασμα ότι το μαθηματικό μοντέλο του Pfaffl είναι πιο ακριβές και αξιόπιστο, καθώς συνυπολογίζει την απόδοση της αντίδρασης.