Μοριακή ανάλυση του μικροβιακού φορτίου ριζικών σωλήνων δοντιών με ασυμπτωματικές και συμπτωματικές περιακρορριζικές βλάβες ενδοδοντικής αιτιολογίας με τη μέθοδο Pyrosequencing

Abstract

Introduction: Endodontic infections have been linked to the commensal oral microbiota, which colonize and proliferate in the root canal system as a consequence of pulp necrosis secondary to caries, tooth trauma, defective restorations or due to a failed endodontic treatment. A thorough understanding of the microbial etiology and characteristics of endodontic infections is a necessary step in developing effective intra-canal antimicrobial protocols. Nevertheless, the exploration and identification of endodontic pathogens remains one of the most challenging aspects in endodontic microbiology, with the majority of bacteria still unknown or uncultivated. Broad-range PCR followed by cloning and Sanger sequencing as well as molecular fingerprinting techniques such as denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) and terminal restriction fragment length polymorphism analysis (T-RFLP) have offered initial insights into the bacterial diversity of the infected root canal system. Nevertheless, despite their high sensitivity, these methods can detect only the most prevalent bacterial community members. The development and application of molecular biology methods has facilitated the identification and linkage of specific bacterial species with periradicular disease and thus have led to the discovery of novel endodontic pathogens. Next-generation sequencing is now part of the toolbox available for 16S rRNA-based bacterial diversity analyses. The technology enables a large number of reads in a single run, providing increased sampling depth compared to other techniques and has the major advantage of enabling the detection of low-abundant genera. So far, only eight studies have used this approach to investigate different types of endodontic infections. From those, only two investigations have examined the endodontic microbiome in teeth with failed endodontic treatment. Even though these persistent infections present an important clinical problem, there is a knowledge gap in their microbial etiology, especially regarding the low-abundant bacteria. Accumulating evidence indicates substantial heterogeneity in the microbiology of endodontic infections among geographically diverse populations. It is unclear whether this heterogeneity is a manifestation of random variation or a reflection of genetic or environmental differences between different populations; nevertheless, it reinforces the importance of examining the endodontic infection microbiome among diverse populations, as this may open the door for possible optimization of intracanal antimicrobial protocols at a population- or individual level. The aim of the present study was to investigate the microbial composition of symptomatic and asymptomatic primary and persistent infections in a Greek population, by using 16S amplicon pyrosequencing. Materials and Methods: 16S amplicon pyrosequencing of 48 bacterial samples was conducted and sequencing data were analyzed using an oral microbiome-specific (HOMD) and a generic (Greengenes; GG) database. Differences in bacterial diversity [Phylogenetic diversity (PD), observed species, Chao1, and Shannon indices] between the 4 EI groups were tested using a mixed-effects linear regression model, accounting for clustering of observations within samples and individuals, and applied a Bonferroni multiple-testing correction to account for multiple pairwise comparisons. To formally test between-group differences in microbial communities Analyses of Similarity (ANOSIM) were employed to calculate R and P values using the phylogeny-based unweighted UniFrac distance metric. Results: A total of 406,070 sequences were obtained from the 48 samples after quality filtering and de-noising corresponding to 8,460 reads per sample (range:2,500-19,024). A total of 339 Operational Taxonomic Units (OTUs) were assigned to 11 phyla, 60 families, and 109 genera. The most abundant phyla were Bacteroidetes (36.2%), Firmicutes (32.9%), Actinobacteria (8.1%), Synergistetes (7.4%), Fusobacteria (7.4%), Proteobacteria (5.2%), Spirochaetes (1.9%), and Tenericutes (0.5%). Persistent infections were significantly enriched for Proteobacteria (6.4% vs. 4.0%; P=0.02) and Tenericutes (0.1% vs. <0.05%; P=0.03) compared to primary ones. Tenericutes were detected in 42% of persistent infections versus 12% of primary infections (P<0.05). Using the GG database, we identified 18 additional less-abundant phyla, all at less than 0.2% abundance. Among those, Cyanobacteria (0.018%) and Acidobacteria (0.007%) were the most abundant, and were significantly enriched among persistent infections: Acidobacteria were detected in 42% of samples with an abundance of 0.1%; Cyanobacteria were detected in 67% of samples with an abundance of 0.3%. At the genus level, Bacteroidaceae_unclassified, Pyramidobacter, and Parvimonas were the most abundant in primary infections whereas Fusobacterium, Bacteroidaceae_unclassified, and Prevotella were the most abundant in teeth with persistent infections. Significant differences were observed for 14 taxa including increased enrichment of persistent infections for Lactobacillus, Streptococcus, Sphingomonas and Ralstonia. In primary infections, symptomatic ones were more diverse that the asymptomatic ones; in persistent infections the opposite was found. Persistent infections showed higher Phylogenetic Diversity compared to primary infections. ANOSIM indicated statistically significant, albeit weak associations of infection type (R=0.087, P=0.005), symptoms (R=0.055, P=0.047), and combined strata (R=0.093, P=0.007) with UniFrac-assessed bacterial community composition. Using the GG database, in primary infections, we identified a total of 24 phyla and 280 genera, whereas these numbers were 28 and 347, respectively in persistent infections. In primary infections, we identified on average 10 phyla, 50 genera, and 112 species-level phylotypes per sample, whereas these numbers were higher (12 phyla, 80 genera, and 162 species-level phylotypes) in teeth with persistent infections. ANOSIM indicated statistically significant but small-in-magnitude association of bacterial composition and infection type according to GG database. Finally, bacteria classified as Elusimicrobia, OP3, OP8, Planctomycetes and WS5 were not detected in primarily infected canals whereas Gemmatimonadetes was the only phylum that was not found in endodontically-treated teeth with persistent infections. Several additional genera were detected using the GG database. Candidatus solibacter, Sharpea, Methylobacterium, Novosphingobium, and Jathinobacterium were the most abundant in this group. Conclusions: In conclusion, the present pyrosequencing study offers a novel, detailed characterization of the endodontic microbiome both in primary and persistent infections. The present results suggest a high bacterial diversity of endodontic infections and a more diverse bacterial community profile in persistent versus primary infections. In addition, primary symptomatic infections tended to be more diverse than primary asymptomatic infections; in contrast persistent symptomatic infections were less diverse than persistent asymptomatic ones. Using the GG database, a substantial number of microorganisms was not possible to be taxonomically classified and may be associated with the development of apical periodontitis. Further endodontic microbiome studies are warranted to identify and characterize these microorganisms.

Εισαγωγή: Η παθογένεση των λοιμώξεων ενδοδοντικής αιτιολογίας συνδέεται με τους μικροοργανισμούς της στοματικής κοιλότητας, που αποικίζουν την πολφική κοιλότητα ως αποτέλεσμα της νέκρωσης του πολφού από τερηδόνα, οδοντικό τραύμα, χαίνουσες αποκαταστάσεις ή που πολλαπλασιάζονται εκ νέου λόγω αποτυχίας της ενδοδοντικής θεραπείας. Η λεπτομερής κατανόηση της μικροβιακής αιτιολογίας και των χαρακτηριστικών των ενδοδοντικών λοιμώξεων είναι αναγκαία για την ανάπτυξη αποτελεσματικών αντιμικροβιακών πρωτοκόλλων. Η διερεύνηση και ταυτοποίηση της μικροβιακής χλωρίδας που αποικίζει την πολφική κοιλότητα παραμένει ένα από τα πιο επίκαιρα θέματα στη Μικροβιολογία της Ενδοδοντολογίας με την πλειοψηφία των βακτηρίων, όπως υποστηρίζεται, να παραμένουν μη ταυτοποιήσιμα ή μη καλλιεργήσιμα. Μέχρι σήμερα, η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης ευρέος φάσματος καθώς και διάφορες μοριακές τεχνικές αποτύπωσης (DGGE, T-RFLP) έχουν ανιχνεύσει και προσδιορίσει μεγάλο τμήμα της μικροβιακής χλωρίδας των ριζικών σωλήνων. Ωστόσο και παρά την υψηλή ευαισθησία τους, οι παραπάνω μέθοδοι μπορούν να ανιχνεύσουν μόνο τους μικροοργανισμούς που ανευρίσκονται με υψηλή συγκέντρωση μέσα στην πολφική κοιλότητα. Ο απευθείας προσδιορισμός των νουκλεοτιδικών αλληλουχιών 2ης γενεάς του τμήματος 16S του βακτηριακού DNA εισήχθη με σκοπό να δώσει λύση στο παραπάνω πρόβλημα. Η συγκεκριμένη τεχνολογία επιτρέπει την ανάγνωση ενός μεγάλου αριθμού αλληλουχιών σε μία και μόνη φορά, παρέχοντας ταυτόχρονα αυξημένο βάθος δειγματοληψίας σε σύγκριση με άλλες τεχνικές με αποτέλεσμα να επιτρέπει την ανίχνευση μικροοργανισμών που ανευρίσκονται με ιδιαίτερα χαμηλή συγκέντρωση μέσα στην πολφική κοιλότητα. Μέχρι σήμερα, οκτώ μόνο μελέτες έχουν χρησιμοποιήσει τη συγκεκριμένη τεχνολογία με σκοπό τη διερεύνηση της ενδορριζικής αλλά και εξωρριζικής μικροβιακής χλωρίδας. Από αυτές, μόνο δύο έχουν εξετάσει τη σύνθεση και την ποικιλότητα της μικροβιακής χλωρίδας σε ενδοδοντικά θεραπευμένα δόντια με περιακρορριζική αλλοίωση. Στις περιπτώσεις αυτές, παρατηρείται ένα σημαντικό κενό στη διεθνή βιβλιογραφία που έχει σχέση κυρίως με τους μικροοργανισμούς που ανευρίσκονται πιθανά σε χαμηλές συγκεντρώσεις μέσα στους ριζικούς σωλήνες. Παράλληλα, ένας σημαντικός αριθμός στοιχείων καταδεικνύουν μια σημαντική ετερογένεια όσον αφορά τη μικροβιακή χλωρίδα των ριζικών σωλήνων ανάμεσα σε γεωγραφικά απομακρυσμένους πληθυσμούς. Δεν είναι ακόμη σαφές αν αυτή η ετερογένεια είναι ένα τυχαίο εύρημα ή είναι πράγματι αποτέλεσμα γενετικών ή περιβαλλοντικών διαφορών μεταξύ των πληθυσμών αυτών. Όλα τα παραπάνω ωστόσο, ενισχύουν τη σημασία της περαιτέρω διερεύνησης της μικροβιακής χλωρίδας των ριζικών σωλήνων, καθώς αυτό μπορεί να οδηγήσει σε πιθανή βελτιστοποίηση των αντιμικροβιακών πρωτοκόλλων της χημικής επεξεργασίας. Σκοπός: Ο σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν η διερεύνηση της σύνθεσης και της ποικιλότητας του συνόλου της μικροβιακής χλωρίδας των ριζικών σωλήνων σε συμπτωματικές και ασυμπτωματικές πρωτογενείς και δευτερογενείς λοιμώξεις ενδοδοντικής αιτιολογίας σε Ελληνικό πληθυσμό, χρησιμοποιώντας τη μέθοδο προσδιορισμού της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας Pyrosequencing. Υλικό και Μέθοδος: Ο προσδιορισμός μέσω πυροφωσφορικού των αλληλουχιών των παραγόμενων αμπλικονίων του τμήματος 16S του βακτηριακού DNA από τα 48 κλινικά μικροβιολογικά δείγματα έλαβε χώρα χρησιμοποιώντας τη βάση δεδομένων HOMD και μια πιο ευρεία βάση, τη βάση Greengenes. Η σύγκριση της αφθονίας (ποσοστό επί του συνόλου ανά δείγμα) και παρουσίας (ποσοστό ανίχνευσης μεταξύ των δειγμάτων) βακτηριακών φύλων και γενών συνολικά και ανά κατηγορία έγινε με τη χρήση μη-παραμετρικών δοκιμασιών Wilcoxon και Fisher’s Exact και με οριακή τιμή P<0,05. Η σύγκριση των τιμών της βακτηριακής ποικιλότητας (δείκτες PD, S, Chao1, και Shannon) μεταξύ των 4 πειραματικών κατηγοριών έγινε μέσω ενός γραμμικού στατιστικού μοντέλου μικτών επιδράσεων (mixed-effects), λαμβάνοντας υπόψη την αλληλεξάρτηση δειγμάτων/δοντιών και συμμετεχόντων και εφαρμόζοντας τη διόρθωση Bonferroni της οριακής τιμής P λόγω πολλαπλών δυαδικών συγκρίσεων. Αποτελέσματα: Μετά τον έλεγχο της ποιότητας των αλληλουχιών, ανιχνεύθηκαν και εξασφαλίστηκαν συνολικά (και από τα 48 δείγματα) 406,070 αλληλουχίες με μέσο όρο 8,460 αλληλουχίες ανά δείγμα. Συμφωνα με τη βάση δεδομένων HOMD, στο επίπεδο των OTUs και σε επίπεδο ομοιομορφίας 97%, έλαβαν χώρα 339 παρατηρήσεις, οι οποίες ταξινομήθηκαν συνολικά σε 11 φύλα (phyla), 60 οικογένειες (families) και 109 γένη (genera). Τα φύλα με τις περισσότερες αλληλουχίες βρέθηκαν να είναι οι Bacteroidetes (36.2%), Firmicutes (32.9%), Actinobacteria (8.1%), Synergistetes (7.4%), Fusobacteria (7.4%), Proteobacteria (5.2%), Spirochaetes (1.9%), και Tenericutes (0.5%). Σημαντικά υψηλότερος αριθμός αλληλουχιών ανιχνεύθηκε για τα Proteobacteria (6.4% vs. 4.0%; P=0.02) και τις Tenericutes (0.1% vs. <0.05%; P=0.03) στις δευτερογενείς σε σχέση με τις πρωτογενείς λοιμώξεις. Σύμφωνα με τη βάση δεδομένων Greengenes, ανιχνεύθηκαν επιπρόσθετα 18 φύλα με ποσοστό ατομικά επι του συνολικού αριθμού αλληλουχιών κάτω του 0.2%. Μεταξύ αυτών, τα Cyanobacteria (0.018%) και τα Acidobacteria (0.007%) ανιχνεύθηκαν με τον υψηλότερο αριθμό αλληλουχιών. Τα Cyanobacteria ανιχνεύθηκαν στο 67% επί του συνόλου των δειγμάτων με ποσοστό αριθμού αλληλουχιών 0.3% ενώ τα Acidobacteria στο 42% επί του συνόλου των δειγμάτων με ποσοστό αριθμού αλληλουχιών 0.1%. Στο επίπεδο του γένους και σύμφωνα με τη βάση HOMD, γένη της οικογένειας Bacteroidaceae, το γένος Pyramidobacter και το γένος Parvimonas ανιχνεύθηκαν με τον υψηλότερο αριθμό αλληλουχιών στις πρωτογενείς λοιμώξεις ενώ το γένος Fusobacterium, γένη επίσης της οικογένειας Bacteroidaceae καθώς και το γένος Prevotella ανιχνεύθηκαν αντίστοιχα με τον υψηλότερο αριθμό αλληλουχιών στις δευτερογενείς λοιμώξεις. Στατιστικά σημαντικές διαφορές όσον αφορά τον αριθμό των αλληλουχιών που ανιχνεύθηκαν μεταξύ δευτερογενών και πρωτογενών λοιμώξεων παρατηρήθηκαν για 14 γένη με περισσότερο αξιοσημείωτη την αυξημένη παρουσία στις δευτερογενείς λοιμώξεις των γενών Lactobacillus, Streptococcus, Sphingomonas, Mycoplasma και Ralstonia. Η αντίστροφη συσχέτιση, με αυξημένη παρουσία στις πρωτογενείς λοιμώξεις βρέθηκε για τα γένη Moryella και Alloprevotella. Οι δευτερογενείς λοιμώξεις κατέγραψαν υψηλότερη βακτηριακή φυλογενετική ποικιλότητα σε σχέση με τις πρωτογενείς λοιμώξεις. Επίσης, οι συμπτωματικές πρωτογενείς λοιμώξεις κατέγραψαν υψηλότερη φυλογενετική ποικιλότητα σε σχέση με τις αντίστοιχες ασυμπτωματικές. Αντίθετα, οι συμπτωματικές δευτερογενείς λοιμώξεις βρέθηκε να καταγράφουν χαμηλότερη φυλογενετική ποικιλότητα σε σχέση με τις αντίστοιχες ασυμπτωματικές. Η στατιστική ανάλυση των ομοιοτήτων με βάση τις φυλογενετικές αποστάσεις UniFrac αποκάλυψε σημαντικές, παρά ταύτα, ασθενείς διαφορές όσον αφορά τη σύνθεση της μικροβιακής χλωρίδας που σχετίζονται τόσο με το είδος της λοίμωξης (R=0.087, P=0.005), με την ύπαρξη ή όχι συμπτωμάτων (R=0.055, P=0.047) όσο και συνδυαστικά των δύο παραπάνω καταστάσεων (R=0.093, P=0.007). Σύμφωνα επίσης, με τη βάση δεδομένων Greengenes, στις περιπτώσεις δοντιών με νεκρό πολφό και περιακρορριζική αλλοίωση ανιχνεύθηκαν 24 βακτηριακά φύλα και 280 βακτηριακά γένη. Αντίθετα, στις περιπτώσεις ενδοδοντικά θεραπευμένων δοντιών ανιχνεύθηκαν 28 βακτηριακά φύλα και 347 βακτηριακά γένη. Τα φύλα Elusimicrobia, OP3, OP8, Planctomycetes και WS5 δεν ανιχνεύθηκαν στα δόντια με νεκρό πολφό και περιακρορριζική αλλοίωση ενώ στα ενδοδοντικά θεραπευμένα δόντια δεν ανιχνεύθηκε το φύλο Gemmatimonadetes. Με τη βάση Greengenes ανιχνεύθηκαν επιπλέον βακτηριακά γένη. Χαρακτηριστικά παραδείγματα αποτελούν τα γένη Candidatus solibacter (Acidobacteria), Sharpea (Firmicutes), Methylobacterium (Proteobacteria), Novosphingobium (Proteobacteria) και Jathinobacterium (Proteobacteria). Συμπεράσματα: Η παρούσα μελέτη προσφέρει μια νέα και ιδιαίτερα λεπτομερή χαρτογράφηση της μικροβιακής χλωρίδας που ευθύνεται τόσο για πρωτογενείς όσο και για εμμένουσες λοιμώξεις ενδοδοντικής αιτιολογίας. Με βάση τον αριθμό των φύλων και γενών που ανιχνεύθηκαν, η βακτηριακή ποικιλότητα της χλωρίδας των ριζικών σωλήνων σε ασθενείς στην Ελληνική Επικράτεια είναι εξίσου μεγάλη με αυτή που έχει ήδη περιγραφεί. Παράλληλα, η μικροβιακή χλωρίδα των ριζικών σωλήνων ενδοδοντικά θεραπευμένων δοντιών με περιακρορριζική αλλοίωση είναι σε σημαντικό βαθμό περισσότερο περίπλοκη και πολυποίκιλη από την αντίστοιχη των δοντιών με νεκρό πολφό και περιακρορριζική αλλοίωση. Σύμφωνα επίσης με τη βάση δεδομένων Greengenes, μεγάλος αριθμός μικροοργανισμών δεν κατέστη δυνατό να ταυτοποιηθεί και που πιθανά να σχετίζεται με την ανάπτυξη περιακρορριζικής παθολογίας. Περαιτέρω μικροβιολογικές μελέτες απαιτείται να λάβουν χώρα στο μέλλον στη βάση αυτή για την ανίχνευση και ταυτοποίηση των μικροοργανισμών αυτών.