Μελέτη της έκφρασης πρωτεϊνών του οξειδωτικού στρες και του στρες του ενδοπλασματικού δικτύου στον πολφό και στην οδοντίνη μετά από έκθεση σε τερηδόνα, μηχανικό τραύμα και ρητινώδη μονομερή

Abstract

The goal of this study was to investigate the role of oxidative and endoplasmic reticulum (ER) stress in the process of reparative dentinogenesis which characterizes the reaction of the dentin-pulp complex to stimuli such as caries, the mechanical trauma caused by a cavity preparation and the application of resinous restorative materials. To achieve this goal, the expression of thioredoxin (Trx1) and its reductase (TrxR1), members of an important antioxidant system, as well as the expression of ERdj5, a protein-marker of ER stress, was studied by immunohistochemistry in paraffin sections of human teeth with caries, a cavity preparation and a filling with a resinous material or fully developed impacted third molars (control teeth). The expression of the proteins was also studied in primary human pulp cell cultures before and after incubation with low concentrations (10, 50, 100μΜ) of HEMA, a monomer released from resinous materials, for 15 minutes, 1 hour and 4 hours. Finally, this study investigated under similar experimental conditions, the expression of dentin sialoprotein (DSP), a protein indispensable for the mineralization of reparative dentin, in combination with ERdj5, by Western Blot and immunofluorescence. The results suggest that mechanisms related to oxidative and ER stress are involved in the process of reparative dentinogenesis. In teeth filled with a resinous material, an increased expression of thioredoxins was observed in the odontoblasts in the reparative dentin area. The expression of ERdj5 was also intense in the same area, mainly in the odontoblastic processes. In teeth with caries, an intense ERdj5 expression was observed in the odontoblasts and the dentinal tubules under the lesion and also in the adjacent pulp cells. In primary human pulp cell cultures, incubation with HEMA did not seem to affect the thioredoxin expression. On the contrary, while under normal culture conditions, ERdj5 expression was covering a large area of the cytoplasm, after incubation with HEMA for one hour, its expression increased and the protein was accumulated in the ER, a finding confirmed by Western Blot. Under similar conditions, DSP expression remained stable but immunofluorescence revealed an obvious relocalization of the protein from the cytoplasm and its accumulation in the ER. These results suggest that a part of the cytotoxicity of low HEMA concentrations in primary human pulp cell cultures may be related to the induction of ER stress. Moreover, the inhibition of mineralization observed under the impact of monomers seems to be related to a possible inhibition of the secretion of DSP, a key protein in reparative dentinogenesis, because of its retainment into the ER.

Στόχος της μελέτης αυτής ήταν να διερευνηθεί ο ρόλος του οξειδωτικού στρες και του στρες του ενδοπλασματικού δικτύου (ER) στη διαδικασία της επανορθωτικής οδοντινογένεσης που χαρακτηρίζει την αντίδραση του συμπλέγματος οδοντίνης-πολφού σε ερεθίσματα όπως η τερηδόνα, το μηχανικό τραύμα από την παρασκευή κοιλότητας και η εφαρμογή ρητινωδών επανορθωτικών υλικών. Για το σκοπό αυτό μελετήθηκε αρχικά με ανοσοϊστοχημεία η έκφραση της θειορεδοξίνης (Trx1) και της αναγωγάσης της (TrxR1), πρωτεϊνών ενός σημαντικού αντιοξειδωτικού συστήματος, καθώς και της ERdj5, πρωτεΐνης-δείκτη του ER στρες, σε τομές παραφίνης ανθρώπινων δοντιών με τερηδόνα, παρασκευή κοιλότητας και έμφραξη με ένα ρητινώδες υλικό ή ακέραιων έγκλειστων τρίτων γομφίων (δόντια ελέγχου). Η έκφραση των πρωτεϊνών μελετήθηκε επίσης σε πρωτογενή καλλιέργεια ανθρώπινων πολφικών κυττάρων πριν και μετά την έκθεσή τους σε χαμηλές συγκεντρώσεις (10, 50, 100μM) του μονομερούς HEMA που απελευθερώνεται από τα ρητινώδη υλικά, για χρονικά διαστήματα 15 λεπτών, 1 ώρας και 4 ωρών. Μελετήθηκε τέλος στις ίδιες συνθήκες η έκφραση της οδοντινικής σιαλοπρωτεΐνης (DSP), πρωτεΐνης με καθοριστικό ρόλο στην ενασβεστίωση της επανορθωτικής οδοντίνης, σε συνδυασμό με την ERdj5, με Western Blot και ανοσοφθορισμό. Τα αποτελέσματα της μελέτης έδειξαν ότι μηχανισμοί που σχετίζονται με το οξειδωτικό και το ER στρες εμπλέκονται πιθανά στη διαδικασία της επανορθωτικής οδοντινογένεσης. Σε δόντια που είχαν εμφραχθεί με ρητινώδες υλικό, παρατηρήθηκε αυξημένη έκφραση των θειορεδοξινών στους οδοντινοβλάστες στην περιοχή της επανορθωτικής οδοντίνης, ενώ έντονη ήταν στην ίδια περιοχή και η έκφραση της ERdj5, κυρίως στις οδοντινοβλαστικές αποφυάδες. Σε δόντια με τερηδόνα, η έκφραση της ERdj5 ήταν έντονη στα οδοντινοσωληνάρια και στους οδοντινοβλάστες στην περιοχή της βλάβης, καθώς και στα παρακείμενα πολφικά κύτταρα. Στις πρωτογενείς καλλιέργειες ανθρώπινων πολφικών κυττάρων, η επώαση με HEMA δεν είχε κάποια επίπτωση στην έκφραση των θειορεδοξινών. Αντίθετα, ενώ κάτω από φυσιολογικές συνθήκες η έκφραση της ERdj5 φαινόταν διάχυτη στο κυτταρόπλασμα, μία ώρα μετά την επώαση με HEMA, παρατηρήθηκε αύξηση στην έκφρασή της, η οποία επιβεβαιώθηκε με το Western Blot, και συγκέντρωσή της με τη μορφή συσσωματωμάτων στο ER. Στο ίδιο χρονικό διάστημα, τα επίπεδα της DSP παρέμειναν σταθερά αλλά παρατηρήθηκε σαφής μετατόπιση της έκφρασής της από το κυτταρόπλασμα στο ER. Ενδέχεται επομένως η κυτταροτοξικότητα του ΗΕΜΑ να οφείλεται κατά ένα μέρος στην πρόκληση ER στρες στα πολφικά κύτταρα. Ειδικά η αναστολή της ενασβεστίωσης που προκαλούν τα μονομερή μπορεί να σχετίζεται με πιθανή αναστολή της έκκρισης πρωτεϊνών που συμμετέχουν στη διαδικασία της επανορθωτικής οδοντινογένεσης όπως η DSP, λόγω κατακράτησής τους μέσα στο ER, σαν αποτέλεσμα της ακολουθίας των αντιδράσεων που προκαλείται από την ενεργοποίηση του ER στρες.