Γενετική και επιγενετική ανάλυση της γονιδιακής έκφρασης των εμβρυϊκών βλαστοκυττάρων του ποντικού κατά τη διαφοροποίηση

Abstract

In the present study we developed a new way of mESC differentiation by treating cells with the deacetylase inhibitor, Trichostatin A (TSA). This treatment resulted in rearrangements of chromatin structure and modifications as well as changes in the expression profile. Pluripotency factors were downregulated and differentiation factors were induced. These changes are similar to those observed during differentiation via the formation of embryoid bodies (EB), but they occur within 12 hours instead of 8 days that the EB need to form. Nevertheless, the effect of TSA was not permanent since after removal of the reagent from the culture, cells were partly reversed in the undifferentiated state, restoring the initial levels of certain factors and certain histone modifications on their promoters. Combination of the above results demonstrated that genes that were transcriptionally down-regulated with simultaneous appearance of 3meK27H3 levels on their promoters, were the ones that could not restore their initial exepression levels upon TSA removal. However, even with the partial reversal, cells remained pluripotent as they were capable of inducing differentiation factors of all 3 germ layers (endoderm, mesoderm, ectoderm) during subsequent differentiation (EB). Among the genes that were severely downregulated during differentiation was sall1. Silencing of this gene resulted in downregulation of Nanog, one of the master pluripotency regulators. After in vitro and in vivo protein interaction experiments it was found that Sall1 protein could physically interact with Nanog and another master pluripotency regulator Sox2. ChIP-on-chip experiments for Nanog and Sall1 revealed that these two factors had a large number of common target genes. Finally, maintenance of Sall1 expression during differentiation prevented certain differentiation factors from being induced, showing that Sall1 plays a role in their suppression in the undifferentiated state and placing it among the factors that a have a role in pluripotency maintenance.

Στην παρούσα μελέτη αναπτύχθηκε ένας νέος τρόπος διαφοροποίησης των εμβρυϊκών βλαστοκυττάρων με τη χρήση ενός αναστολέα απακετυλασών, την Τριχοστατίνη Α (TSA). Επώαση των κυττάρων με TSA προκάλεσε αναδιαμόρφωση της χρωματινικής δομής και των τροποποιήσεων των ιστονών αλλά και αλλαγές στο πρότυπο γονιδιακής έκφρασης με τους παράγοντες πλειοδυναμίας και διαφοροποίησης να καταστέλλονται και να επάγονται μεταγραφικά, αντίστοιχα. Οι αλλαγές αυτές είναι παρόμοιες με εκείνες που λαμβάνουν χώρα κατά τη διαφοροποίηση των κυττάρων μέσω του σχηματισμού των εμβρυϊκών σωματίων (ΕΒ) αλλά συμβαίνουν σε διάστημα 12 ωρών αντί 8 ημερών. Η δράση της TSA δεν ήταν μόνιμη καθώς μετά την απομάκρυνσή της από την καλλιέργεια τα κύτταρα επανήλθαν μερικώς στην αρχική κατάσταση, αποκαθιστώντας τα αρχικά επίπεδα έκφρασης ορισμένων παραγόντων και κάποιες από τις αρχικές τροποποίησεις στους αντίστοιχους υποκινητές. Συνδυασμός των παραπάνω αποτελεσμάτων έδειξε πως εκείνα τα γονίδια που κατά την καταστολή τους αποκτούσαν αυξημένα επίπεδα τριμεθυλίωσης της λυσίνης 27 στην ιστόνη 3 (3meK27H3), δεν μπορούσαν να επανέλθουν στην αρχική κατάσταση έκφρασης μετά την απομάκρυνση της TSA. Παρόλα αυτά, τα κύτταρα παρέμεναν πλειοδύναμα αφού όταν διαφοροποιήθηκαν μέσω του σχηματισμού των ΕΒ παρατηρήθηκε επαγωγή παραγόντων διαφοροποίησης και των τριών κατευθύνσεων (ενδόδερμα, μεσόδερμα, εκτόδερμα). Ανάμεσα στους παράγοντες που εμφάνισαν τη μεγαλύτερη καταστολή κατά τη διαφοροποίηση ήταν ο παράγοντας Sall1. Αποσιώπηση του γονιδίου του οδήγησε στη μεταγραφική καταστολή του nanog, ενός από τους σημαντικότερους παράγοντες πλειοδυναμίας, ενώ μετά από in vitro και in vivo πειράματα πρωτεϊνικών αλληλεπιδράσεων βρέθηκε πως αλληλεπιδρά με τους παράγοντες πλειοδυναμίας Nanog και Sox2. Μετά από ανοσοκατακρήμνιση χρωματίνης και ανάλυση μικροσυστοιχειών υποκινητών βρέθηκε πως οι παράγοντες Sall1 και Nanog εντοπίζονται στους υποκινητές κοινών γονιδίων-στόχων. Τέλος, διατήρηση της έκφρασης του Sall1 κατά τη διαφοροποίηση παρεμπόδισε την επαγωγή μεσοδερμικών και εκτοδερμικών παραγόντων διαφοροποίησης υποδηλώνοντας πως ο παράγοντας αυτός παίζει ρόλο στην καταστολή τους στην αδιαφοροποίητη κατάσταση και τοποθετώντας τον ανάμεσα στους παράγοντες που συμβάλλουν στη διατήρηση της πλειοδυναμίας των εμβρυικών βλαστοκυττάρων.