Μελέτη των οδών μεταγωγής σήματος Notch και Wnt σε ασθενείς με εξαιρέσιμο χειρουργικά καρκίνο του λάρυγγα

Abstract

Αγγλική ΠερίληψηThe aim of this thesis was to study, molecules of biological pathways Wnt and Notch in patients with laryngeal cancer. Using the methods of tissue microarrays and immunohistochemistry was assessed at the protein level, the expression of the transmembrane receptors Notch1 to 3 and ligand Jagged1 in the Notch pathway, while the Wnt pathway proteins probed B-catenin, E-cadherin and P-cadherin. At the mRNA level, with the qRT-PCR method, from the Notch pathway the molecules Notch1 to 4 were investigated, and the molecules AXIN2, MMP7, SFRP2, SFRP4, SNAI1, SNAI2 and WNT5A for the Wnt pathway. This study was conducted in a biological material, which was retrospectively collected from total 289 patients with non-metastatic, resectable, squamous cell carcinoma of the larynx. Patients whose tumors overexpressed cytoplasmic E-cadherin and Β-catenin exhibited higher median overall survival (OS) compared to those patients whose tumors overexpressed only the Β-catenin. Patients whose tumors overexpressed both at cytoplasme and membrane the E-cadherin showed higher median disease-free survival (DFS) compared to those where only found cytoplasmic overexpression of E-cadherin. The high nuclear protein expression of Jagged1 ligated with greater DFS and OS, in contrast to the adverse prognostic value of Notch3 expression for both DFS and OS. Patients with high expression of Notch3 without the presence or with low nuclear and cytoplasmic expression of the ligand Jagged1 exhibited worse DFS and OS. Positive predictive influence both on DFS and in the OS, showed in patients with the combination of low-moderate expression of Notch2 and low expression of cytoplasmic Jagged1. The hierarchical grouping of SFRP4, SNAI2 and WNT5A RQ-values revealed three groups (Clusters). The first group (Cluster 1) included tumors with common coexpression of SFRP4, SNAI2 and WNT5A mRNA, the third group (Cluster 3) patients with tumors under-expression of SNAI2 and WNT5A, while the second group (Cluster 2) included all other RQ-values for all three genes. In univariate and multivariate analysis, the clusters showed prognostic value in both DFS and the OS, the cluster 2, compared with the two other clusters, associated with a relatively favorable prognosis, whereas clusters 1 and 3 were associated with high risk of relapse and death. In multivariate analysis of the Wnt pathway independent adverse prognostic factors for DFS and OS were age at diagnosis (over 63 years) and the presence of lymph node metastasis. High cytoplasmic expression of E-cadherin was independent favorable ratio only with respect to the OS. In multivariate analysis of the Notch pathway, independent adverse effect on DFS emerged when there was either high expression of Notch3 or high cytoplasmic protein expression Jagged1. In contrast, when the high protein expression of Notch2 combined with low cytoplasmic protein expression Jagged1, positive influence obtained on DFS and OS. In the case of the simultaneous overexpression of Notch2 and cytoplasmic Jagged1 protein, emerged tendency of worse effect on OS. Adverse indicators in DFS and OS also was the subglottic and transglottic location of tumor and nodal metastasis, while in the DFS only unfavorable outcome indicator was and total laryngectomy.

Ελληνική ΠερίληψηΣκοπός της παρούσας διδακτορικής διατριβής ήταν να μελετηθούν, μόρια των βιολογικών οδών Wnt και Notch, σε ασθενείς με καρκίνωμα λάρυγγα. Χρησιμοποιώντας τις μεθόδους των ιστικών μικροσυστοιχιών και ανοσοϊστοχημείας αξιολογήθηκε, σε επίπεδο πρωτεΐνης, η έκφραση μορίων του μονοπατιού Notch και ειδικότερα των διαμεμβρανικών υποδοχέων Notch1 έως 3 και του συνδέτη Jagged1. Από το μονοπάτι Wnt διερευνήθηκαν οι πρωτεΐνες B-κατενίνη, E-καντχερίνη και P-καντχερίνη. Σε επίπεδο mRNA, με τη μέθοδο qRT-PCR, μελετήθηκε η έκφραση μορίων Notch1 έως 4 του μονοπατιού Notch. Από το μονοπάτι Wnt διερευνήθηκαν τα μόρια AXIN2, ΜΜΡ7, SFRP2, SFRP4, SNAI1, SNAI2 και WNT5A. Η μελέτη πραγματοποιήθηκε σε βιολογικό υλικό, το οποίο συλλέχθηκε αναδρομικά από συνολικά 289 ασθενείς με μη μεταστατικό, χειρουργικά εξαιρέσιμο καρκίνωμα από πλακώδες επιθήλιο του λάρυγγα. H μέση και η 5-ετής ελεύθερη νόσου επιβίωση (ΕΝΕ/DFS) ήταν 94.5 μήνες και 60.8% αντίστοιχα, ενώ η μέση και 5-ετής συνολική επιβίωση (ΣΕ/OS) ήταν 106 μήνες και 66.1% αντίστοιχα. Οι ασθενείς των οποίων οι όγκοι υπερέκφραζαν την κυτταροπλασματική E-καντχερίνη και B-κατενίνη εμφάνισαν μεγαλύτερη μέση OS/ΣΕ σε σύγκριση με τους ασθενείς των οποίων οι όγκοι υπερέκφραζαν μόνο τη B-κατενίνη. Ασθενείς των οποίων οι όγκοι υπερέκφραζαν κυτταροπλασματικά και μεμβρανικά την E-καντχερίνη παρουσίασαν μεγαλύτερη μέση DFS/ΕΝΕ σε σύγκριση με εκείνους στους οποίους, βρέθηκε μόνο κυτταροπλασματική υπερέκφραση αυτής. Η υψηλή πυρηνική έκφραση της πρωτεΐνης Jagged1 συνδέθηκε με μεγαλύτερη DFS/ΕΝΕ και OS/ΣΕ. Οι ασθενείς με υψηλή έκφραση του Notch3 χωρίς παρουσία του συνδέτη Jagged1 ή με χαμηλή έκφραση αυτού, εμφάνιζαν δυσμενέστερη DFS/ΕΝΕ και OS/ΣΕ. Θετική προγνωστική επίδραση τόσο στη DFS/ΕΝΕ όσο και στην OS/ΣΕ, φάνηκε σε ασθενείς με το συνδυασμό χαμηλής-μέτριας έκφρασης του Notch2 και χαμηλής κυτταρο-πλασματικής έκφρασης της πρωτεΐνης Jagged1. Η ιεραρχική ομαδοποίηση των SFRP4, SNAI2 και WNT5A RQ-τιμών, ανέδειξε 3 ομάδες (Clusters). Η 1η ομάδα (Cluster 1) περιελάμβανε όγκους με κοινή συνέκφραση των SFRP4, SNAI2 και WNT5A mRNA, η 3η ομάδα (Cluster 3) όγκους ασθενών με υποέκφραση των SNAI2 και WNT5A, ενώ η 2η ομάδα (Cluster 2) αφορούσε όλες τις άλλες RQ-τιμές εκτός των παραπάνω και για τα τρία γονίδια. Στη μονοπαραγοντική και στην πολυπα-ραγοντική ανάλυση, τα clusters εμφάνισαν προγνωστική αξία σε σχέση με την επιβίωση. Το cluster 2 σχετίζεται με σχετικά ευνοϊκότερη πρόγνωση, ενώ τα clusters 1 και 3 συνδέονταν με υψηλό κίνδυνο για υποτροπή και θάνατο. Στην πολυπαραγοντική ανάλυση της οδού Wnt ανεξάρτητοι δυσμενείς προγνωστικοί παράγοντες για DFS/ΕΝΕ και OS/ΣΕ ήταν η ηλικία κατά τη διάγνωση (άνω των 63 ετών) και η παρουσία τραχηλικής λεμφαδενικής μετάστασης. Η υψηλή κυτταρο-πλασματική έκφραση της E-καντχερίνης ήταν ανεξάρτητος ευνοϊκός δείκτης μόνο σε σχέση με την OS/ΣΕ. Στην πολυπαραγοντική ανάλυση της οδού Notch, με δυσμενή επίδραση στη DFS/ΕΝΕ σχετίσθηκε η υψηλή έκφραση της Notch3 και η υψηλή κυτταροπλασματική έκφραση της Jagged1. Η υψηλή έκφραση της Notch2 όταν συνδυάστηκε με χαμηλή κυτταροπλασματική έκφραση της Jagged1, επέδρασε θετικά στη DFS/ΕΝΕ και στην OS/ΣΕ. Η ταυτόχρονη όμως, υπερέκφραση της Notch2 και της κυτταροπλασματικής Jagged1 πρωτεΐνης, επέδρασε δυσμενώς στην OS/ΣΕ. Δυσμενείς δείκτες για DFS/ΕΝΕ και OS/ΣΕ ήταν η υπογλωττιδική-διαγλωττιδική εντόπιση, η ηλικία άνω των 63 ετών και η λεμφαδενική μετάσταση. Στη DFS/ΕΝΕ ευνοϊκό δείκτη αποτέλεσε η ολική λαρυγγεκτομή.