Genome organization, functional analysis of biosynthetic genes and metabolic diversity of triterpenes in legumes

Abstract

Triterpenes are plant secondary metabolites, derived from the cyclization of 2,3- oxidosqualene by oxidosqualene cyclases (OSCs). The role of lupeol synthase, encoded by OSC3, and its product, lupeol, was investigated in developing roots and nodules of the model legume Lotus japonicus. The expression patterns of OSC3 in different developmental stages of uninfected roots and in roots infected with Mesorhizobium loti were determined. The tissue specificity of OSC3 expression was analysed by in situ hybridization. Functional analysis, in which transgenic L. japonicus roots silenced for OSC3 were generated, was performed. The absence of lupeol in the silenced plant lines was determined by GC-MS. The expression of ENOD40, a marker gene for nodule primordia initiation, was increased significantly in the OSC3-silenced plant lines, suggesting that lupeol influences nodule formation. Silenced plants also showed a more rapid nodulation phenotype, consistent with this. Exogenous application of lupeol to M. loti-infected wild-type plants provided further evidence for a negative regulatory effect of lupeol on the expression of ENOD40. The synthesis of lupeol in L. japonicus roots and nodules can be solely attributed to OSC3. Taken together, our data suggest a role for lupeol biosynthesis in nodule formation through the regulation of ENOD40 gene expression. In addition, genes for triterpene biosynthetic pathways exist as metabolic gene clusters in oat and Arabidopsis thaliana plants. The presence of an analogous gene cluster in the model legume L. japonicus was characterized. In the genomic regions flanking the oxidosqualene cyclase AMY2 gene, genes for two different classes of cytochrome P450 and a gene predicted to encode a reductase were identified. Functional characterization of the cluster genes was pursued by heterologous expression in Nicotiana benthamiana. The gene expression pattern was studied under different developmental and environmental conditions. The physiological role of the gene cluster in nodulation and plant development was studied in knockdown experiments. A novel triterpene structure, dihydrolupeol, was produced by AMY2. A new plant cytochrome P450, CYP71D353, which catalyses the formation of 20-hydroxybetulinic acid in a sequential three-step oxidation of 20-hydroxylupeol was characterized. The genes within the cluster are highly co-expressed during root and nodule development, in hormone-treated plants and under various environmental stresses. A transcriptional gene silencing mechanism that appears to be involved in the regulation of the cluster genes was also revealed. A tightly co-regulated cluster of functionally related genes is involved in legume triterpene biosynthesis, with a possible role in plant development.

Τα τριτερπένια είναι φυτικοί δευτερογενείς μεταβολίτες που προέρχονται από την κυκλοποίηση του 2,3-οξειδοσκουαλενίου από εξειδικευμένα ένζυμα, τις συνθάσες ή κυκλάσες του οξειδοσκουαλενίου. Ο ρόλος της συνθάσης της λουπεόλης, που κωδικοποιείται από το γονίδιο OSC3, καθώς και το προϊόν του, λουπεόλη, διερευνήθηκε σε αναπτυσσόμενες ρίζες και φυμάτια του μοντέλου-ψυχανθούς Lotus japonicus. Τα πρότυπα έκφρασης του γονιδίου OSC3 σε διάφορα αναπτυξιακά στάδια μη μολυσμένων και μολυσμένων ριζών με το συμβιώτη Mesorhizobium loti καθορίστηκαν. Η ιστοειδική έκφραση του γονιδίου OSC3 καθορίστηκε με in situ υβριδισμό. Πραγματοποιήθηκε λειτουργική ανάλυση σε μετασχηματισμένες ρίζες που παρουσίαζαν αποσιώπηση του γονιδίου OSC3. Στις μετασχηματισμένες ρίζες καθορίστηκε η απουσία παραγωγής λουπεόλης με GC-MS. Τα μετασχηματισμένα φυτά παρουσίασαν το φαινότυπο της πιο ταχείας φυματιογένεσης σε σύγκριση με τα φυτά – μάρτυρες. Επιπλέον, η έκφραση του γονιδίου ENOD40, γονίδιο δείκτης της έναρξης σχηματισμού των καταβολών των φυματίων, αυξήθηκε σημαντικά στα μετασχηματισμένα φυτά. Η εξωγενής παροχή λουπεόλης σε αγρίου τύπου φυτά παρείχε επιπλέον ενδείξεις για τον αρνητικό ρυθμιστικό ρόλο της λουπεόλης στην έκφραση του γονιδίου ENOD40. Η βιοσύνθεση της λουπεόλης μπορεί να αποδωθεί αποκλειστικά στο γονίδιο OSC3. Λαμβάνοντας όλα αυτά υπ’όψιν, προτείνεται στη λουπεόλη ένας ρόλος στο σχηματισμό των φυματίων μέσω της ρύθμισης της έκφρασης του γονιδίου ENOD40. Επιπρόσθετα, τα γονίδια που συμμετέχουν σε μονοπάτια βιοσύνθεσης τριτερπενοειδών οργανώνονται σε γονιδιακές συστοιχίες στα φυτά της βρώμης και του Arabidopsis thaliana. Η παρουσία μιας ανάλογης γονιδιακής συστοιχίας στο φυτό L. japonicus ταυτοποιήθηκε. Στη γονιδιωματική περιοχή που εδράζεται το γονίδιο της συνθάσης της β-αμυρίνης, εντοπίστηκαν δύο γονίδια του κυτοχρώματος Ρ450 καθώς και μία ρεδουκτάση. Ο λειτουργικός χαρακτηρισμός της γονιδιακής συστοιχίας πραγματοποιήθηκε με ετερόλογη έκφραση σε φύλλα Nicotiana benthamiana. Μια καινούρια δομή τριτερπενοειδούς, η διυδρολουπεόλη, παράγεται από την συνθάση της β-αμυρίνης. Επιπλέον, ένα καινούριο ένζυμο του κυτοχρώματος Ρ450, το CYP71D353, χαρακτηρίστηκε, το οποίο καταλύει το σχηματισμό του 20-hydroxybetulinic acid μέσω τριών διαδοχικών βημάτων οξείδωσης της διυδρολουπεόλης. Τα πρότυπα έκφρασης των γονιδίων μελετήθηκαν σε διαφορετικές αναπτυξιακές και περιβαλλοντικές συνθήκες. Τα γονίδια της συστοιχίας συν-εκφράζονται κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης των φυματίων και των ριζών, σε φυτά που υποβληθήκαν σε καταπονήσεις και σε φυτά που αναπτύχθηκαν παρουσία ορμονών. Ο φυσιολογικός ρόλος της γονιδιακής συστοιχίας στη φυματιογένεση και στην φυτική ανάπτυξη μελετήθηκε σε μετασχηματισμένα φυτά με αποσιώπηση. Επιπλέον, αποκαλύφθηκε ένας μηχανισμός επιγενετικής τροποποίησης που πιθανά εμπλέκεται στη ρύθμιση της γονιδιακής συστοιχίας. Μια γονιδιακή συστοιχία που αποτελείται από λειτουργικά συσχετιζόμενα γονίδια εμπλέκεται στη βιοσύνθεση τριτερπενοειδών στα ψυχανθή και πιθανά εμπλέκεται στη φυτική ανάπτυξη.