Ανάπτυξη ενιαίας μεθόδου σαρώσεως απαγορευμένων ουσιών σε ούρα αθλητών με την τεχνική GC/MS, για εφαρμογή σε εργαστήρια ελέγχου doping

Abstract

Critical requirement in doping control laboratories is the identification of a large number of prohibited substances with different properties, in low concentrations, found in different biological fluids, such as urine. Nowadays, most doping control laboratories follow different sample preparation and the respective analytical procedures for this purpose. The development of a unified screening method is necessary for saving cost, time and human resources. The present work, carried out in the framework of WADA funded research project, investigates the development of a unified screening method for the identification of prohibited substances, in athlete urine samples, through the use of GC/TOFMS technology. The screening method includes a common sample preparation and the respective analytical protocol. The first involves the hydrolysis, extraction and derivatization steps. The experimental protocol for the development of a unified derivatization method was focused on the formation of TMS-derivatives. The optimization of the proposed derivatization process was followed. The optimized two-step procedure, with a total duration of 20 min, allowed for the detection of 190 prohibited substances in a concentration equal to the Minimum Required Performance Level (MRPL). The experimental protocol for the development of a unified extraction procedure includes four experiment series. At first, the solid phase (SPE) and liquid-liquid extraction (LLE) protocols were studied in unhydrolysed urine samples. The combination of SPE and LLE resulted in a cleaner background and satisfying results in regard to the detection of the compounds of interest. The aforementioned protocols together with those of exclusive LLE extraction were tested on hydrolyzed urine. As a result of these tests, 9 protocols giving high recovery and low variance were applied for the extraction of the total number of compounds in urine samples at MRPL. Eventually, LLE with diethylether as extraction solvent was selected. The application of the unified method includes the analysis by GC/TOFMS, of urine samples that were prepared by the unified sample preparation procedure. For this reason, the retention times with the main diagnostic ions for the compounds of interest, were firstly defined. Macros were modified in the instrument software for the automation of data processing. 169 prohibited substances were identified with S/N greater than 3 and excellent mass accuracy out of 183 substances that were studied in urine samples at MRPL. Part of those substances that were not identified with GC/TOFMS can be identified with LC/TOFMS. The unified screening method allows for the identification of large number of substances in athletes’ urine samples with good performance due to its high resolution and mass accuracy in full scan mode.

Βασική απαίτηση για τα εργαστήρια ελέγχου ντόπινγκ αποτελεί η ικανότητα προσδιορισμού ενός μεγάλου αριθμού απαγορευμένων ουσιών με διαφορετικές ιδιότητες, σε χαμηλές συγκεντρώσεις και σε διάφορα βιολογικά υγρά, όπως τα ούρα. Τα περισσότερα εργαστήρια χρησιμοποιούν για το σκοπό αυτό διαφορετικές παρασκευαστικές και αναλυτικές διαδικασίες. Η ανάπτυξη μιας ενιαίας μεθόδου σαρώσεως θα ήταν επιθυμητή, καθώς θα μπορούσε να οδηγήσει σε σημαντική εξοικονόμηση χρόνου, κόστους και ανθρώπινου δυναμικού. Η παρούσα εργασία, εξετάζει την ανάπτυξη ενιαίας μεθόδου σαρώσεως για την ανίχνευση απαγορευμένων ουσιών σε δείγματα ούρων αθλητών με την τεχνολογία GC/TOFMS. Η μέθοδος σάρωσης θα πρέπει να περιλαμβάνει κοινή παρασκευαστική πορεία και ενιαίο στάδιο αναλυτικής μέτρησης. Η πρώτη περιλαμβάνει τα στάδια της υδρόλυσης, εκχύλισης και παραγωγοποίησης. Το πειραματικό πρωτόκολλο για την ανάπτυξη ενιαίας μεθόδου παραγωγοποίησης επικεντρώθηκε στο σχηματισμό τριμεθυλοσιλυλο-παραγώγων. Ακολούθησεβελτιστοποίηση της προτεινόμενης πορείας παραγωγοποίησης. Η βελτιστοποιημένη πορεία παραγωγοποίησης δυο σταδίων, διάρκειας 20 min επέτρεψε την ανίχνευση 190 ουσιών σε συγκέντρωση ίση με το Ελάχιστο Απαιτούμενο Όριο Απόδοσης (MRPL). Το πειραματικό πρωτόκολλο για την ανάπτυξη ενιαίας μεθόδου εκχύλισης περιλαμβάνει 4 σειρές πειραμάτων. Αρχικά εξετάστηκαν πρωτόκολλα εκχύλισης στερεάς φάσης (SPE) και υγρό-υγρό εκχύλισης (LLE), σε μη υδρολυμένα ούρα. Συνδυασμός SPE και LLE οδήγησε σε καθαρισμό του υποβάθρου και ικανοποιητικά αποτελέσματα. Τα πρωτόκολλα αυτά, καθώς και πρωτόκολλα μόνο με LLE δοκιμάστηκαν σε υδρολυμένα ούρα. Τα βέλτιστα πρωτόκολλα εφαρμόστηκαν για την εκχύλιση του συνόλου των εξεταζομένων ουσιών στο MRPL. Τελικά, επιλέχθηκε εκχύλιση με διαιθυλαιθέρα. Η εφαρμογή κοινής αναλυτικής πορείας περιλαμβάνει την ανάλυση δειγμάτων ούρων που παρασκευάστηκαν με την ενιαία παρασκευαστική πορεία και ενιαία αναλυτική μέθοδο με GC/TOFMS. Προσδιορίστηκαν αρχικά οι χρόνοι ανάσχεσης, καθώς και τα κύρια διαγνωστικά ιόντα για τις μελετούμενες ουσίες. Ακολούθως προσαρμόστηκαν macro στο λογισμικό του οργάνου. Από τις 183 ουσίες που εξετάστηκαν, προσδιορίστηκαν με λόγο S/N>3, 169 απαγορευμένες ουσίες. Μέρος των ουσιών που απέτυχαν να ανιχνευθούν με GC/TOFMS, ανιχνεύονται με LC/TOFMS. Η ενιαία μέθοδος σάρωσης επιτρέπει την ανίχνευση ενός μεγάλου αριθμού ουσιών σε δείγματα ούρων αθλητών, με εξαιρετικές δυνατότητες λόγω της υψηλής διαχωριστικής ικανότητας και της ακρίβειας προσδιορισμού μαζών με λειτουργία πλήρους σάρωσης.