Γενετικοί παράγοντες που καθορίζουν την εκδήλωση του βρογχικού άσθματος σε παιδιά καθώς και την ανταπόκριση των ασθενών αυτών στη φαρμακευτική αγωγή

Abstract

Childhood asthma is a chronic airway inflammatory disease resulting from the interaction between environmental and genetic factors. Atopy, which is characterized by increased levels of specific IgE against common environmental allergens, is considered one of the strongest predisposing factors for childhood asthma. Regarding therapy, inhaled corticosteroids (ICS) have been recognized as the preferred long-term control therapy in patients with asthma, including children of all ages. Notably, high inter-individual variability in response to ICS treatment is found, with up to 40% of patients with asthma not responding sufficiently. In addition, family studies have shown genetic heritability in sensitization to allergens, response to glucocorticoid therapy and asthma control level.Nitric oxide synthase (NOS) enzymes have important role in regulating airway inflammation in asthmatic children. Genetic loci that encode nitric oxide synthase (NOS) enzymes affect nitric oxide (NO) formation, which plays a key role as an inflammatory mediator in the airways. Furthermore, the vitamin D pathway has recently emerged as a new potential component of asthma and allergy susceptibility. Vitamin D levels have been suggested as a marker of disease severity in asthmatic children. The functions of vitamin D depend also on individual Vitamin D Receptor (VDR) and Vitamin D Binding Protein (VDBP) genetic variability. Serotonin (5-HT) has also been reported to regulate the airway inflammation and bronchial hyperreactivity in asthma pathophysiology.The aim of this study was to investigate the possible association of genetic polymorphisms of NO, vitamin D and serotonin pathways with childhood asthma susceptibility, the sensitization of asthmatic children to common inhaled allergens, the asthmacontrol level, and the response to inhaled corticosteroids in combination with LABAs.Our study population consisted of 193 children diagnosed as having asthma and 96 healthy controls all of Greek origin. The sensitization to common allergens was defined according to skin prick test reactions for 8 aeroallergens. Asthma control level was defined according to GINA criteria and the C-ACT questionnaire for asthma control level assessment for all asthmatic children aged 5-12 years old not receiving anti-asthmatic treatment at least 6 months prior to their enrollment in this study. The response to inhaled corticosteroids (ICS) with long acting b2-agonists (LABAs) was recorded as % change in FEVi over baseline. Children who had shown improvement more than 7.5% of predicted FEVi over baseline at least once during the 12 month treatment period were classified as responders (FEVi change >7.5%). Healthy control group was consisted of children without personal or family history of asthma or atopy.The total of children participating in this study was genotyped for the following polymorphisms: G894T and -786T/C of endothelial nitric oxide synthase gene (eNOS), Ser608Leu of inducible nitric oxide synthase gene (iNOS), rs7975232 of Vitamin D receptor gene (VDR), rs7041 and rs4588 of Vitamin D binding protein gene (VDBP), 5-HTTLPR of 5-HT transporter gene (5-HTT), and 102T/C of 2A serotonin receptor gene (5-HTR2A). Genomic DNA was extracted from white blood cells and polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP) were used for identification of eNOS G894T and -786T/C, iNOS Ser608Leu, VDR rs7975232, VDBP rs7041 and rs4588, 5-HTT 5-HTTLPR, and 5-HTR2A 102T/C polymorphisms.According to our results, all the studied polymorphisms were not associated with childhood asthma susceptibility. However, the 894GG genotype was more frequent (68.6%) in asthmatic children sensitized to Olea europeae compared with asthmatic children non-sensitized (43.0%o) (p=0.004). Similarly, the frequency of -786TT genotype was higher in asthmatic children sensitized to Olea europeae (51.0%) than in non-sensitized (31.7%) asthmatic children to this allergen (p=0.035). For the Parietaria judaica and mixed grass, the frequency of -786C allele carriage was associated with protection from sensitization to Parietaria judaica and mixed grass in asthmatic children (p=0.021 and p=0.017, respectively). Also, the VDR Apal CC genotype was associated with protection from sensitization to Parietaria judaica (p=0.055), Mixed grass (p=0.043), and Alternaria alternate (p=0.022) and the rs4588 A A genotype was associated with sensitization to Dermatophagoides pteronys sinus (p=0,015).For asthma control level, in asthmatic children, those with the VDR Apal CC genotype had significantly higher C-ACT score compared with asthmatic children carrying the AA/AC VDR Apal genotypes (p=0.015). The frequency of VDR Apal CC genotype was significantly higher in controlled asthma group than uncontrolled asthma group according to C-ACT (26.2% vs 0.0%, p=0.001) and GINA (33.3% vs 9.1%, p=0.017) classifications. Also, VDR Apal CC genotype was negatively associated with limitation in daily activities because of asthma (p=0.006).Regarding pharmacogenetic results, among asthmatic children, 894TT carriers had much more pronounced change in FEVi than 894GG carriers (21.9±3.8% versus 1.6±1.9%, pO.001). In responders (FEVi change >7.5%), frequency of 894TT genotype was significantly higher than in non-responders (26.2% vs 2.6%, pO.001). Also, carriers of 894T allele were almost 5 times more likely to respond to ICS than 894GG carriers (OR=5.1, p=0.001). Results with -786T/C polymorphism, alone or combined with G894T polymorphism, were less clear and in most cases non significant.In conclusion, eNOS G894T and -786T/, as well as VDR Apal and VDBP rs4588 polymorphisms, were associated with sensitization to common aeroallergens in asthmatic children. Furthermore, the VDR Apal polymorphism was significantly associated with asthma control level in asthmatic children 5-12 years old not receiving any anti-asthmatic treatment. Regarding pharmacogenetics, the eNOS 894TT genotype was significantly associated with response to ICS plus LABA in asthmatic children.

Το παιδικό άσθμα είναι μια χρόνια φλεγμονώδης νόσος των αεραγωγών που προκύπτει από την αλληλεπίδραση περιβαλλοντικών και γενετικών παραγόντων. Η ατοπία θεωρείται ένας από τους βασικούς προδιαθεσικούς παράγοντες εκδήλωσης παιδικού άσθματος. Όσον αφορά την αντιμετώπιση του, τα εισπνεόμενα κορτικοστεροειδή (ICS) έχουν αναγνωριστεί ως η προτιμώμενη μακροχρόνια θεραπεία στους ασθενείς με άσθμα ακόμη και στην παιδική ηλικία. Αξίζει να σημειωθεί ότι παρατηρείται μεγάλη ποικιλομορφία στην ανταπόκριση στη θεραπεία με ICS με περίπου το 40% των ασθενών με άσθμα να μην ανταποκρίνονται ικανοποιητικά. Επιπλέον, μελέτες σε οικογένειες έχουν αναδείξει το ρόλο της κληρονομικότητας στην ευαισθητοποίηση στα αλλεργιογόνα, την ανταπόκριση στη θεραπεία με γλυκοκορτικοειδή και το επίπεδο ελέγχου του άσθματος.Οι συνθάσες του μονοξειδίου του αζώτου (NOS) έχουν σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση της φλεγμονής των αεραγωγών στα παιδιά με άσθμα. Οι γενετικοί τόποι που κωδικοποιούν τα ένζυμα των NOS επηρεάζουν το σχηματισμό του μονοξειδίου του αζώτου (NO), το οποίο έχει ρόλο φλεγμονώδους μεσολαβητή στους αεραγωγούς. Επιπλέον, το μονοπάτι της βιταμίνης D έχει πρόσφατα αναδειχθεί ως πιθανός παράγοντας που συμβάλλει στην εκδήλωση άσθματος και ατοπίας. Τα επίπεδα της βιταμίνης D έχουν προταθεί ως δείκτης βαρύτητας της νόσου σε παιδιά με άσθμα και οι δράσεις της βιταμίνης D ρυθμίζονται και από την ατομική γενετική ποικιλομορφία του υποδοχέα και του μεταφορέα της βιταμίνης D (VDR και VDBP, αντίστοιχα). Η σεροτονίνη (5-ΗΤ) έχει, επίσης, αναφερθεί ότι ρυθμίζει τη φλεγμονή των αεραγωγών και την βρογχική υπεραντιδραστικότητα στην παθοφυσιολογία του άσθματος.Σκοπός της μελέτης ήταν η διερεύνηση πιθανής συσχέτισης πολυμορφισμών γονιδίων που εμπλέκονται στα μονοπάτια του μονοξειδίου του αζώτου (NO), της βιταμίνης D και της σεροτονίνης με i) την εκδήλωση άσθματος, ii) την ευαισθητοποίηση των παιδιών με άσθμα στα συνήθη αεροαλλεργιογόνα, iii) το επίπεδο ελέγχου του άσθματος και iv) την ανταπόκριση στα εισπνεόμενα κορτικοστεροειδή (ICS) σε συνδυασμό με μακράς διάρκειας β2-αγωνιστές (LAB As).Ο πληθυσμός της μελέτης αποτελούταν από 193 παιδιά ελληνικής καταγωγής με άσθμα και 96 παιδιά χωρίς άσθμα. Η ευαισθητοποίηση στα συνήθη αλλεργιογόνα ελέγχθηκε με δερματικές δοκιμασίες για τα επιλεγμένα αλλεργιογόνα. Το επίπεδο ελέγχου του άσθματος καθορίστηκε σύμφωνα με τα κριτήρια της GINA και το C-ACT ερωτηματολόγιο για την εκτίμηση ελέγχου του άσθματος για παιδιά ηλικίας 5-12 ετών που δεν λάμβαναν θεραπεία για το άσθμα τουλάχιστον 6 μήνες πριν την εισαγωγή τους στη μελέτη. Η ανταπόκριση στα ICS σε συνδυασμό με LAB As καταγράφηκε ως η % αλλαγή στη FEVi συγκριτικά με την τιμή της κατά την έναρξη της μελέτης. Ως ανταπόκριση ορίστηκε η βελτίωση μεγαλύτερη από 7.5% στην προβλεπόμενη τιμή της FEVi συγκριτικά με την τιμή της κατά την έναρξη της μελέτης κατά τη διάρκεια των 12 μηνών θεραπείας. Τα παιδιά της ομάδας ελέγχου αποτελούταν από παιδιά χωρίς ατομικό ή οικογενειακό ιστορικό άσθματος ή ατοπίας και αρνητικές δερματικές δοκιμασίες.Στο σύνολο των παιδιών που συμμετείχαν στη μελέτη έγινε γονοτύπηση για τους ακόλουθους πολυμορφισμούς: G894T και -786T/C του γονιδίου της ενδοθηλιακής συνθάσης του μονοξειδίου του αζώτου (eNOS), Ser608Leu του γονιδίου της επαγώγιμης συνθάσης του μονοξειδίου του αζώτου (iNOS), rs7975232 του γονιδίου του υποδοχέα της βιταμίνης D (VDR), rs7041 και rs4588 του γονιδίου του μεταφορέα της βιταμίνης D (VDBP), 5-HTTLPR του γονιδίου του μεταφορέα της 5-ΗΤ (5-ΗΤΤ) και 102T/C του γονιδίου του 2Α υποδοχέα της σεροτονίνης (5-HTR2A). Γενωμικό DNA απομονώθηκε από τα λευκά αιμοσφαίρια και η γονοτύπηση για τους μελετώμενους πολυμορφισμούς eNOS G894T και -786T/C, iNOS Ser608Leu, VDR rs7975232, VDBP rs7041 και rs4588, 5-HTT 5-HTTLPR και 5-HTR2A 102T/C έγινε με την αντίδραση αλυσιδωτής πολυμεράσης και πέψη με περιοριστικήενδονουκλεάση (PCR-RFLP).Σύμφωνα με τα αποτελέσματα, κανένας από τους μελετώμενους πολυμορφισμούς δεν συσχετίστηκε με τον κίνδυνο εκδήλωσης παιδικού άσθματος. Ωστόσο, ο 894GG γονότυπος ήταν πιο συχνός (68.6%) στα ασθματικά παιδιά που ήταν ευαισθητοποιημένα για το αλλεργιογόνο Olea Europeae συγκριτικά με τα ασθματικά παιδιά που δεν ήταν ευαισθητοποιημένα (43.0%) (ρ=0.004). Ομοίως, η συχνότητα του -786ΤΤ γονότυπου ήταν μεγαλύτερη στα ασθματικά παιδιά που ήταν ευαισθητοποιημένα στο αλλεργιογόνο Olea europeae (51.0%) συγκριτικά με τα ασθματικά που δεν ήταν ευαισθητοποιημένα σε αυτό το αλλεργιογόνο (31.7%) (ρ=0.035). Για τα αλλεργιογόνα Parietaria judaica και mixed grass, η συχνότητα των γονότυπων -786TC ή -786CC συσχετίστηκε με προστασία από την ευαισθητοποίησης στα αλλεργιογόνα Parietaria judaica και mixed grass στα ασθματικά παιδιά (ρ=0.021 και ρ=0.017, αντίστοιχα). Οι πολυμορφισμοί του συστήματος NO συσχετίστηκαν με τα τρία πιο συχνά αεροαλλεργιογόνα στην Ελλάδα. Επίσης, ο γονότυπος VDR Apal CC συσχετίστηκε με προστασία από ευαισθητοποίηση στα αλλεργιογόνα Parietaria judaica (ρ=0.055), Mixed grass (ρ=0.043) και Alternaria alternate (ρ=0.022) και ο γονότυπος rs4588 Α Α συσχετίστηκε με την ευαισθητοποίηση στο αλλεργιογόνο Dermatophagoidespteronyssinus (ρ=0.015).Όσον αφορά το επίπεδο ελέγχου του άσθματος, μεταξύ των ασθματικών παιδιών, αυτά με τον γονότυπο VDR Apal CC είχαν σημαντικά μεγαλύτερο άθροισμα στο C-ACT ερωτηματολόγιο συγκριτικά με τα παιδιά που είχαν τους γονότυπους AA/AC VDR Apal (ρ=0.015). Η συχνότητα του γονότυπου VDR Apal CC ήταν σημαντικά μεγαλύτερη στα παιδιά με ελεγχόμενο άσθμα συγκριτικά με τα παιδιά με μη-ελεγχόμενο άσθμα σύμφωνα με το C-ACT ερωτηματολόγιο (26.2% έναντι 0.0%, ρ=0.001) και τα κριτήρια GINA (33.3% vs 9.1%, ρ=0.017). Επιπλέον, ο γονότυπος VDR Apal CC συσχετίστηκε αρνητικά με τον περιορισμό των καθημερινών δραστηριοτήτων εξαιτίας του άσθματος (ρ=0.006).Για τα αποτελέσματα της φαρμακογενετικής μελέτης, μεταξύ των παιδιών με άσθμα, όσα έφεραν τον γονότυπο eNOS 894 ΤΤ είχαν σημαντικά μεγαλύτερη αλλαγή στη FEVi συγκριτικά με τα παιδιά που είχαν τον 894GG γονότυπο (21.9±3.8% έναντι 1.6±1,9%, ρ<0.001) μετά από θεραπεία με ICS και LAB As για 12 μήνες. Στα παιδιά που ανταποκρίθηκαν (αλλαγή στη FEVi >7.5%), η συχνότητα του γονότυπου 894ΤΤ ήταν σημαντικά μεγαλύτερη σε σχέση με τα παιδιά που δεν ανταποκρίθηκαν (26.2%) έναντι 2.6%, ρ<0.001). Επιπλέον, όσα παιδιά έφεραν το 894Τ αλληλόμορφο είχαν πενταπλάσια πιθανότητα να ανταποκριθούν στη θεραπεία με ICS και LABAs συγκριτικά με τα παιδιά που είχαν τονγονότυπο 894GG (OR=5.1, ρ=0.001). Τα αποτελέσματα για τους υπόλοιπους πολυμορφισμούς ήταν αρνητικά όσον αφορά τον έλεγχο της ανταπόκρισης στη θεραπεία με ICS και LABAs των παιδιών με άσθμα.Συμπερασματικά, οι πολυμορφισμοί eNOS G894T και -786Τ/ όπως και οι VDR Apal και VDBP rs4588 συσχετίστηκαν με την ευαισθητοποίηση στα συνήθη αεροαλλεργιογόνα στα παιδιά με άσθμα. Επιπλέον, ο πολυμορφισμός VDR Apal συσχετίστηκε με τον έλεγχο του άσθματος στα παιδιά με άσθμα ηλικίας 5-12 ετών που δεν λάμβαναν αντι-ασθματική αγωγή. Όσον αφορά τη φαρμακογενετική, ο γονότυπος eNOS 894ΤΤ συσχετίστηκε με την ανταπόκριση των παιδιών με άσθμα στη θεραπεία με ICS και LABAs.