Λειτουργική ανάλυση νέων γονιδίων που εμπλέκονται στη διαφοροποίηση της ενδοκρινούς μοίρας του παγκρέατος

Abstract

The aim of this thesis was the identification and functional analysis of novel genes, targets of Ngn3, implicated in endocrine pancreas development. In a screen conducted for downstream Ngn3 target genes using ES derived pancreas progenitors we identified Aldh1b1, encoding a mitochondrial enzyme, as one of the genes strongly upregulated in response to Ngn3 expression. Αldehydedehydrogenase (ALDH) genes are increasingly associated with stem/progenitor cell status but their role in the maintenance of pluripotency remains uncertain. We found both by in situ hybridization and immunofluorescence using a specific antibody that ALDH1B1 is exclusively expressed in the emerging pancreatic buds of the early embryo (9.5 dpc) in a Pdx1 dependent manner. Around the time of secondary transition, ALDH1B1 expression was restricted in the tiptripotent progenitors of the branching epithelium and in a subset of the trunk epithelium. Expression in the latter was Ngn3 dependent. Subsequently, ALDH1B1 expression persisted only in the tip cells that become restricted to the exocrine lineage and declined rapidly as these cells mature. In the adult pancreas we identified rare ALDH1B1⁺ cells that become abundant following pancreas injury in mice injected with cerulein (for acinar cell destruction) or streptozotocin (for beta cell destruction). Moreover blocking ALDH catalytic activity in embryonic pancreas explants in culture resulted in reduced size of the explants and accelerated differentiation suggesting for the first time that ALDH activity may be necessary in the developing pancreas for the maintenance and expansion of progenitor pools.

Η παρούσα διδακτορική διατριβή είχε ως στόχο την ταυτοποίηση και την λειτουργική ανάλυση νέων γονιδίων στόχων του μεταγραφικού παράγοντα Ngn3. O Ngn3 είναι ένας από τους σημαντικότερους παράγοντες που καθορίζουν την πορεία διαφοροποίησης των πρόδρομων κυττάρων του παγκρέατος προς ινσουλινοπαραγωγά β-κύτταρα. H ερευνητική μας ομάδα, στο παρελθόν είχε πραγματοποιήσει κατευθυνόμενη διαφοροποίηση εμβρυονικών βλαστοκυττάρων προς β-κύτταρα, με επαγωγή του Νgn3. Πειράματα μικροσυστοιχιών γονιδιακής έκφρασης στα κύτταρα αυτά, έδειξαν ισχυρή επαγωγή της έκφρασης του γονίδιου Aldh1b1, μετά από επαγωγή του Ngn3. Το Aldh1b1 ανήκει στην οικογένεια των δεϋδρογονασών των αλδεϋδών, μέλη της οποίας έχουν βρεθεί να εκφράζονται σε πρόδρομα/αδιαφοροποίητα κύτταρα αλλά ο ρόλος τους στην διατήρηση της πολυδυναμίας των κυττάρων αυτών δεν έχει αποσαφηνιστεί. Χρησιμοποιώντας μεθόδους επιτόπιου υβριδισμού RNA και ανοσοφθορισμού με αντίσωμα ειδικό για το ALDH1B1, δείξαμε ότι το Aldh1b1 εκφράζεται από τα πρώτα στάδια της ανάπτυξης του παγκρέατος στα πολυδύναμα αρχέγονα κύτταρα (9.5 dpc) καθώς επίσης ότι η έκφραση του εξαρτάται από αυτή του Pdx1. Επιπροσθέτως δείξαμε ότι στο στάδιο της δευτερογενούς ανάπτυξης, το ALDH1B1 εκφράζεται στα πολυδύναμα πρόδρομα κύτταρα στις κορυφές του επιθηλίου και σε ένα πληθυσμό κυττάρων στον αυλό του επιθηλίου. Η έκφρασή του στα κύτταρα του αυλού δείχτηκε ότι εξαρτάται από αυτή του Ngn3. Σε μεταγενέστερα στάδια της εμβρυϊκής ανάπτυξης δείξαμε ότι η έκφραση του ALDH1B1 περιορίζεται αποκλειστικά στα εξωκρινή κύτταρα στις κορυφές του επιθηλίου και ότι η έκφραση του μειώνεται σταδιακά καθώς τα κύτταρα ωριμάζουν. Εν συνεχεία στο ενήλικο πάγκρεας παρατηρήσαμε την ύπαρξη σπανίων ALDH1B1⁺ κεντροκυψελιδικών κυττάρων, τα οποία αυξάνονται δραματικά μετά από επαγωγή παγκρεατίτιδας με ενδοφλέβια χορήγηση σερουλεϊνης και στρεπτοζοτοκίνης. Παράλληλα καταστολή της ALDH ενζυμικής δραστηριότητας σε 11.5 dpc παγκρέατα τα οποία καλλιεργήθηκαν παρουσία του γενικού αναστολέα DEAB, οδήγησε σε μείωση του μεγέθους τους και σε πρόωρη, αυξημένη διαφοροποίηση κυρίως των ενδοκρινών κυττάρων. Τα αποτελέσματα αυτά υποδηλώνουν ένα σημαντικό ρόλο για την ALDH ενζυμική δραστηριότητα στη διατήρηση της βλαστικότητας και τον πολλαπλασιασμό των πρόδρομων κυττάρων του παγκρέατος κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης.