Η επίδραση της τακρολίμης στην επούλωση αναστομώσεων του παχέος εντέρου επιμύων σε συνθήκες αποφρακτικού ειλεού

Abstract

The aim of this thesis was to investigate the effects of tacrolimus on colonic anastomotic healing in rats under obstructive conditions. Eighty male rats were randomized in 4 (1, 2, 3, 4) groups of 2 equal subgroups (a, b) each. The animals of group 1 (control) and 3 (tacrolimus) underwent colonic segment followed by a primary end-to-end anastomosis, while in these of group 2 (obstructive ileus) and 4 (obstructive ileus and tacrolimus) the anastomosis was performed in the same way, 24 hours after the large bowel was mechanically obstructed. Moreover, the animals of group 3 and 4 were injected subcutaneously with tacrolimus in a dose of 0.1mg/kg body weight immediately postoperatively and daily until the day of sacrifice, while these of group 1 and 2 with 1ml of NaCl 0.9%, respectively. Depending on their subgroup, half of the rats (subgroup 1a, 2a, 3a, 4a) were sacrificed on the 4th postoperative day while the remaining (subgroup 1b, 2b, 3b, 4b) on the 8th. During post-mortem examination, the abdominal cavity and the anastomoses were examined macroscopically. The anastomotic integrity, the presence of perianastomotic abscess and the formation of adhesions or any signs of generalized peritonitis, were recorded. The adhesion formation was evaluated in a blind fashion according to the scale of van der Hamm. Immediately after sacrifice, the bursting pressure was recorded. Afterwards, during microscopic evaluation, inflammatory cell infiltration (white blood cell count), fibroblast activity, new blood vessel formation (neoangiogenesis) and collagen deposition were graded in a blind fashion using the Ehrlich and Hunt numerical scale, as modified by Philips. Finally, in the remaining anastomotic segment, the concentration of hydroxyproline, as well as the enzymatic activity of collagenase I was estimated. The experimental data were summarized using statistical descriptive indices of central tendency and dispersion (i.e. absolute and relative frequencies, means, medians, minimum and maximum values, and std. deviations). For each parameter examined, the Least Significant Difference (LSD) criterion was adopted for comparison of mean values. In each case, the standard error of the mean differences used in LSD testing procedure was computed from the results of a two-way ANOVA. Fisher’s exact test was applied for percentages’ comparisons. We demonstrated that in the tacrolimus-treated animals the mean body weight decrease was significantly lower; moreover tacrolimus reduced the inflammatory reaction and simultaneously increased the neongiogenesis and the collagen formation. Its specific acts resulted to increased bursting pressures on both the days of study. We concluded that tacrolimus after subcutaneous administration promotes significantly the healing of colonic anastomoses in rats under obstructive conditions and the result seems to be better after 8-day administration.

Σκοπός της παρούσας διδακτορικής διατριβής ήταν η πειραματική μελέτη της επίδρασης της τακρολίμης στην επούλωση αναστομώσεων του παχέος εντέρου επίμυων σε συνθήκες αποφρακτικού ειλεού. Για τη μελέτη χρησιμοποιήθηκαν 80 άρρενες επίμυες, οι οποίοι χωρίστηκαν τυχαιοποιημένα σε 4 (1, 2, 3, 4) ομάδες, με 2 (α, β) ισοδύναμες υποομάδες έκαστη. Στην ομάδα 1 (ελέγχου) και 3 (τακρολίμη) διενεργήθηκε τμηματική εντερεκτομή και τελικοτελική αναστόμωση. Στην ομάδα 2 (ειλεός) και 4 (ειλεός και τακρολίμη) επιτεύχθηκαν αρχικά συνθήκες αποφρακτικού ειλεού και 24 ώρες μετά διενεργήθηκε τμηματική εντερεκτομή και τελικοτελική αναστόμωση. Η τακρολίμη χορηγήθηκε στις ομάδες 3 και 4 σε δόση 0,1mg/kg Β.Σ. υποδορίως, διεγχειρητικά και κάθε ημέρα μέχρι τη θυσία, ενώ αντίστοιχα στις ομάδες 1 και 2 στα πειραματόζωα χορηγούνταν 1ml διαλύματος NaCl 0,9%. Σε κάθε ομάδα τα μισά πειραματόζωα (υποομάδα 1α, 2α, 3α, 4α) θυσιάστηκαν την 4η μετεγχειρητική ημέρα και τα υπόλοιπα (υποομάδα 1β, 2β, 3β, 4β) την 8η. Κατά τη νεκροτομή γινόταν μακροσκοπικός έλεγχος για ρήξη της αναστόμωσης, ύπαρξη περιτονίτιδος ή περιαναστομωτικού αποστήματος καθώς και ποσοτική αξιολόγηση των συμφύσεων σύμφωνα με την κλίμακα Van der Hamm. Ακολουθούσε μέτρηση της πίεσης διάσπασης και στη συνέχεια τμήμα της αναστόμωσης αποστέλλονταν για ιστολογική εξέταση κατά την οποία αξιολογούνταν η φλεγμονώδης αντίδραση (διήθηση από ουδετερόφιλα), ο αριθμός των ινοβλαστών, η νεοαγγειογένεση και η εναπόθεση νεοκολλαγόνου. Η ταξινόμηση των μικροσκοπικών ευρημάτων έγινε σύμφωνα με την κλίμακα Ehrlich και Hunt με τις τροποποιήσεις κατά Phillips. Επιπλέον, προσδιορίστηκε βιοχημικά η συγκέντρωση υδροξυπρολίνης και κολλαγενάσης I επί της αναστόμωσης. Για την συνοπτική παρουσίαση των αποτελεσμάτων υπολογίστηκαν απόλυτες και σχετικές συχνότητες (ποσοστά %), δείκτες κεντρικής τάσης (μέσοι όροι, διάμεσες τιμές) και δείκτες διασποράς (ελάχιστες τιμές, μέγιστες τιμές, τυπικές αποκλίσεις) και για τη σύγκριση των μέσων όρων χρησιμοποιήθηκε το κριτήριο της Ελάχιστης Σημαντικής Διαφοράς (Least Significant Difference-LSD), μετά από την εφαρμογή της μεθόδου ANOVA (Analysis of Variance). Από την ανάλυση των πειραματικών δεδομένων προέκυψε ότι σε συνθήκες αποφρακτικού ειλεού, η χορήγηση τακρολίμης προκαλεί μικρότερη ελάττωση στο σωματικό βάρος, περιορίζει τη φλεγμονώδη αντίδραση, ενώ αυξάνει τη νεοαγγειογένεση και το σχηματισμό νεοκολλαγόνου. Αρχικά και μέχρι την 4η ημέρα που η κολλαγονόλυση είναι αυξημένη, ελαττώνει τα επίπεδα κολλαγενάσης I, ενώ επιταχύνει τον πολλαπλασιασμό των ινοβλαστών. Σταδιακά, με τη μετάβαση στην όψιμη φάση της επούλωσης ενισχύει τη νεοκολλαγονογένεση αλλά και την εναπόθεση κολλαγόνου στην περιοχή της αναστόμωσης, όπως προκύπτει από την αυξημένη συγκέντρωση νεοκολλαγόνου και υδροξυπρολίνης στην περιοχή της αναστόμωσης την 8η μετεγχειρητική ημέρα. Οι δράσεις της αυτές έχουν σαν αποτέλεσμα την ενίσχυση της μηχανικής ισχύος των αναστομώσεων, όπως αυτή εκφράζεται από την αύξηση των πιέσεων διάσπασης. Συμπερασματικά, η υποδόρια χορήγηση τακρολίμης μετεγχειρητικά, ενισχύει σημαντικά την επούλωση των αναστομώσεων του παχέος εντέρου σε συνθήκες αποφρακτικού ειλεού και μάλιστα τα αποτελέσματά της είναι καλύτερα όταν χορηγηθεί για 8 ημέρες.