Μελέτη μηχανισμών μεταγωγής σήματος μετά από επίδραση χημειοθεραπευτικών παραγόντων στον ανθρώπινο καρκίνο

Abstract

In the context of the present PhD thesis, we investigated the anti-oncogenic properties of specific members of the benzoquinone ansamycin family of antibiotics in human bladder cancer cell lines of diverse malignancy grade and genetic background. The molecular techniques implemented in order to assess the biological effects of ansamycins on bladder cancer cell cultures in vitro were: fluorescence activated cell sorting (FACS) experiments, MTT tests, Western blottings, semi-quantitative RT-PCRs, electrophoretic mobility shift assays (EMSA), immunofluorescence and confocal microscopy, scratch wound assays, autophagy detection and 2DGE (2-dimensional gel electrophoresis), followed by proteomic analysis. The experimental data presented herein display the response mechanisms of bladder cancer cells due to drug-induced Hsp90 inhibition and the dose-dependent downregulation of its individual protein-clients. We have unveiled the multidimensional effect of Hsp90 inhibition upon the whole spectrum of cellular physiology by containment of various signaling cascades, furthermore resulting in the repression of the hallmark traits of cancer, while we also revealed new biomarkers for the clinical staging of human urinary bladder cancer. Conclusively, our experimental data reflect the prominent therapeutic value and clinical importance of benzoquinone ansamycins, denoting their central role in modern targeted chemotherapy of bladder cancer, and likely in other types of human malignancy.

Στο πλαίσιο της συγκεκριμένης διατριβής μελετήθηκε η επίδραση επιλεγμένων μελών των ανσαμυκινών τύπου βενζοκινόνης σε καρκινικές κυτταρικές σειρές ανθρώπινης ουροδόχου κύστης διαφορετικού βαθμού κακοήθειας και γενετικού υποβάθρου. Οι μοριακοί χειρισμοί που πραγματοποιήθηκαν για την ανάλυση της επίδρασης των συγκεκριμένων παραγόντων σε in vitro καλλιέργειες κυτταρικών σειρών ουροδόχου κύστης περιελάμβαναν: αντιδράσεις κυτταρομετρίας ροής (FACS), δοκιμασίες προσδιορισμού κυτταρικής βιωσιμότητας (MTT), ανοσοστυπώματα Western, ημι-ποσοτικές αλυσιδωτές αντιδράσεις πολυμεράσης (RT-PCR), δοκιμασίες μεταβολής ηλεκτροφορητικής ικανότητας λόγω πρόσδεσης (EMSA), ανοσοκυτταροχημεία και συνεστιακή σαρωτική μικροσκοπία laser, δοκιμασίες «επούλωσης» πληγής, δοκιμασίες προσδιορισμού λυσοσωμικής ενεργότητας και ολική πρωτεωμική ανάλυση. Συνοπτικά, αναδείχθηκαν οι μηχανισμοί απόκρισης των καρκινικών κυττάρων ουροδόχου κύστης στην φαρμακο-επαγόμενη αναστολή της Hsp90 από τα αντιβιοτικά ανσαμυκίνης, καθώς και η δοσο-εξαρτώμενη μειορύθμιση των επιμέρους πρωτεϊνών-«πελατών» της. Αποκαλύφθηκε η πολυδιάστατη επίδραση της Hsp90 αναστολής σε ολόκληρο το φάσμα της κυτταρικής φυσιολογίας, με την ανάσχεση πολλαπλών σηματοδοτικών μονοπατιών, οδηγώντας σε καταστολή των φαινοτυπικών χαρακτηριστικών του καρκίνου, ενώ πραγματοποιήθηκε η αποκάλυψη νέων βιολογικών δεικτών για την κλινική σταδιοποίηση του καρκίνου της ουροδόχου κύστης. Τέλος, παρουσιάστηκαν πειραματικά στοιχεία τα οποία αντικατοπτρίζουν την υψηλή θεραπευτική αξία και κλινική σπουδαιότητα των ανσαμυκινών τύπου βενζοκινόνης, αναδεικνύοντας τον κεντρικό ρόλο τους στη σύγχρονη στοχευμένη θεραπεία του καρκίνου της ουροδόχου κύστης, και ενδεχομένως άλλων τύπων ανθρώπινης νεοπλασματικής εξαλλαγής.