Αξιολόγηση των επιπέδων των μεταλοπρωτεινασών στο σπερματικό πλάσμα νορμοζωοσπερμικών, ολιγοτερατοζωοσπερμικών και αζωοσπερμικών ανδρών

Abstract

AbstractMatrix metalloproteinases (MMPs) and the FAS/FAS ligand (FASL) system are known to play a key role in germ cell death, maintaining the immune status of the testes. MMPs belong to a large family of enzymes with the ability of tissue reconstruction. One of their roles is the release and activation of growth factors and cytokines. In human sperm, MMPs activate the function of apoptotic factors, as FASL. FASL is expressed by Sertolli cells eliminating activated T-cells that express FAS, and gametes are protected from rejection reactions. Additionally, the binding of FASL to FAS activates apoptosis during spermatogenesis, thus leading to the elimination of the abnormal gametes and the reduction of the population matching the capacity of Sertoli cells. Given the crucial role of the MMPs as well as of the FAS/FAS Ligand system in the regulation of germ cell death, we aimed to investigate the presence of the MMP-2, MMP-9 and the soluble forms of Fas (sFAS) and Fas Ligand (sFASL) in seminal plasma and their possible involvement in male infertility. For this aim, semen samples were obtained from seventy-two men (age: 38.76±9.06 years). Basic semen analysis was performed according to the WHO Laboratory Manual and seminal plasma was isolated and used for the detection of MMP-2, MMP-9, sFAS and sFASL levels. The levels of MMP-2, MMP-9, sFAS and sFASL were quantified with ELISA using immunoassay kits and correlation analysis between expression levels and semen characteristics followed. Semen analysis demonstrated that twenty four samples were considered normal, and within the abnormal six were oligozoospermic, six asthenospermic, one teratozoospermic, five oligoasthenoteratozoospermic, one asthenoteratozoospermic, fourteen oligoasthenozoospermic, two oligoteratozoospermic, six azoospermic and seven with low vitality.Concerning the MMPs, both were detected in the samples; however only for MMP-9 a quiantitative analysis was possible. There was no statistical significant difference of MMPs levels in normal and abnormal samples, however the levels of MMP-9 in abnormal samples were slightly higher. Correlation analysis showed that in abnormal samples there were statistically significant correlations with sperm vitality, slow motility, immotile sperm and time to liquefaction. sFAS and sFASL were detected in both normal and abnormal samples, and their levels in abnormal samples were slightly higher, but not statistically significant. Correlation analysis showed that sFAS correlated negatively with pH in both normal (R = - 0,49) and abnormal samples (R = - 0,36). In normal samples, sFAS was strongly positively correlated with sperm concentration (R = 0,60). Furthermore, in abnormal samples, sFAS concentrations were strongly correlated with those of sFASL (Spearman R = 0,40; p<0.001).Concluding, both factors of FAS/FASL system have been detected in seminal plasma.

Οι μεταλλοπρωτεΐνάσες (MMPs), όπως επίσης το σύστημα της πρωτεΐνης FAS και του συνδέτη της (FAS Ligand - FASL) έχουν αποδειχθεί ότι παίζουν έναν ιδιαίτερα κομβικό ρόλο στον κυτταρικό θάνατο, διατηρώντας το ανοσοποιητικό σύστημα των όρχεων σε ισορροπία. Οι μεταλλοπρωτεϊνάσες αποτελούν μια οικογένεια πρωτεασών με την ικανότητα να ανασχηματίζουν ιστούς. Ένας από τους ρόλους τους είναι η απελευθέρωση και η ενεργοποίηση αυξητικών παραγόντων και κυτταροκινών. Στο σπερματικό πλάσμα έχει αποδειχθεί ότι οι MMPs ενεργοποιούν την λειτουργία αποπτωτικών παραγόντων, όπως ο FASL. Ο FASL εκφράζεται από τα κύτταρα Sertoli με σκοπό να εξαλείψει τα ενεργοποιημένα Τ λεμφοκύτταρα που εκφράζουν FAS. Με αυτόν τον τρόπο, οι γαμέτες προστατεύονται από τις αντιδράσεις απόρριψης που μπορούν να προκληθούν από το ανοσοποιητικό σύστημα. Επιπρόσθετα, έχει περιγραφεί ότι το σύστημα FAS-FASL στους όρχεις ενεργοποιεί την απόπτωση κατά τη σπερματογένεση, μειώνοντας τον αριθμό των ανώμαλων γαμετών και του συνολικού πληθυσμού τους.Δεδομένου του σημαντικού αυτού ρόλου των μεταλλοπρωτεΐνασών και του συστήματος FAS/FASL, η παρούσα διδακτορική διατριβή είχε ως σκοπό να διερευνήσει την παρουσία των ΜΜP-2 και MMP-9, όπως επίσης και των διαλυτών μορφών της πρωτεΐνης FAS και του FASL στο σπερματικό υγρό και να τη συσχετίσει με την ανδρική υπογονιμότητα. Για το σκοπό της παρούσας μελέτης αναλύθηκαν 72 δείγματα ασθενών. Αρχικά πραγματοποιήθηκε σπερμοδιάγραμμα σύμφωνα με τις οδηγίες του Παγκόσμιου Οργανισμού Υγείας και στη συνέχεια απομονώθηκε το σπερματικό υγρό. Τα επίπεδα των MMP-2, MMP-9, και των διαλυτών μορφών των FAS και FASL μετρήθηκαν με τη διαγνωστική ανοσοενζυμική μέθοδο ELISA και στη συνέχεια συσχετίστηκαν με τα αποτελέσματα του σπερμοδιαγράμματος. Σύμφωνα με το σπερμοδιάγραμμα, 24 δείγματα χαρακτηρίσθηκαν ως φυσιολογικά και 48 μη φυσιολογικά. Από τα μη φυσιολογικά τα 6 ήταν ολιγοζωοσπερμικά, τα 6 ασθενοσπερμικά, 1 τερατοζωοσπερμικό, 5 ολιγοασθενοτερατοζωοσπερμικά, 1 ασθενοτερατοζωοσπερμικό, 14 ολιγοασθενοζωοσπερμικά, 2 ολιγοτερατοζωοσπερικά, 6 αζωοσπερικά και 7 με χαμηλή ζωτικότητα. Όσον αφορά στις MMPs, ανιχνεύθηκαν ποιοτικά και οι δύο, ωστόσο μόνο για τη MMP-9 κατέστη ικανή η ποσοτική ανίχνευσή της. Δεν παρατηρήθηκε στατιστικά σημαντική διαφορά των επιπέδων MMP-9 ανάμεσα στα φυσιολογικά και μη δείγματα, ωστόσο δείχθηκε μια τάση να είναι υψηλότερα στα μη φυσιολογικά. Ανάλυση συσχέτισης έδειξε ότι μόνο στα μη φυσιολογικά δείγματα βρέθηκαν στατιστικά σημαντικές συσχετίσεις της με τη ζωτικότητα, τη μη προωθητική κίνηση, το ποσοστό των ακίνητων σπερματοζωαρίων και το χρόνο ρευστοποίησης. Όσον αφορά στο σύστημα FAS/FASL, σε όλα τα δείγματα ανιχνεύθηκαν οι μορφές sFAS και sFASL. Σε όλα τα μη φυσιολογικά δείγματα τα επίπεδα τους ήταν ελαφρώς αυξημένα, ωστόσο όχι στατιστικά σημαντικά. Ανάλυση συσχέτισης έδειξε επίσης ότι η πρωτεΐνη sFAS συσχετίζεται αρνητικά με το pH τόσο σε φυσιολογικά, όσο και σε μη φυσιολογικά δείγματα. Σε φυσιολογικά δείγματα η sFAS συσχετίστηκε με τη συγκέντρωση του σπέρματος. Επιπροσθέτως, στα μη φυσιολογικά δείγματα,η συγκέντρωση της sFAS συσχετίστηκε με τη συγκέντρωση του sFASL.