Πρωτεομική ανάλυση του πράσινου θειοβακτήριου Chlorobium tepidum

Abstract

Chlorobium tepidum is a Gram-negative, thermophilic, green sulfur bacterium (Chlorobia), obligate anaerobic photolithoautotroph and is widely distributed in aquatic environments, where anoxic layers containing reduced sulfur compounds are exposed to light. Recently, the genome fromthe green sulfur bacterium Chl. tepidum was sequenced but the function of a large number of genes remains unknown. Many genes were found to be highly conserved among photosynthetic species and seemed to have no clear function within Chl. tepidum, however, these genes are thought to play specific roles in photosynthesis or photobiology. Characterization of different gene products can be achieved through proteomics approaches. The corresponding genes may then be identified from the genome sequence by determining the N-terminal sequence of the protein or by using mass spectroscopic sequencing and identification methods. An extensive proteomic approach relies on the possibility to visualize and analyze various types of proteins, including membrane proteins, which are rarely detectable on two-dimensional electrophoresis gels. In this study, different methods were employed for the proteomic analysis of the soluble and membrane fraction of Chlorobium tepidum. Initially, we tried the enrichment of membrane proteins from Chlorobium tepidum prior to analysis with two-dimensional electrophoresis (2-DE). Isolated membranes were solubilized with Triton X-100 and from the supernatant we identified 58 unique proteins. The use of ionic sodium dodecyl sulfate (SDS) for protein solubilization, combined with acetone precipitation, resulted in an improved 2-DE pattern and the total number of the identified proteins was increased to 117. The use of acetone for protein precipitation improved the results by extracting compounds potentially deleterious to the resolution of 2-DE. However, the additional proteins detected by the use of SDS are in themajoritymore difficult to solubilize than less hydrophobic proteins. Further our attempts for selective extraction of the outer membrane proteins using the acid glycine method allowed the identification of 37 proteins of which 14 were predicted to have a signal sequence indicating their localization in the periplasmic space or in the outer membrane. The identification of a significant amount of soluble proteins, especial ribosomal proteins, in the membrane fraction of Chl. tepidum indicated the necessity to wash the membranes prior any further analysis. For that purpose the isolated membranes of Chl. tepidum were washed with two different salts, EDTA and NaBr. The washed membranes in both procedures were collected with ultracentrifugation. The supernatant and the membranes resulted from both procedures were analyzed with absorption spectroscopy, Tricine-SDS-PAGE and the total amount of protein was estimated using the Bradford assay. Tricine-SDS-PAGE and Bradford assay showed that the washed with EDTA membranes contained more proteins than the washed with NaBr membranes. In total, using MALDI TOF MS 119 different proteins were identified from the Tricine-SDS-PAGE of the washed with EDTA membranes, while only 93 different proteins were identified from the Tricine-SDS-PAGE of the washed with NaBr membranes. The supernatant from the two different procedures were different. In the case of the washed with EDTA membranes the supernatant was transparent having a light redbrown color, while the supernatant in the case of NaBr was separated in two distinct phases. One viscous dark green phase and one transparent light olive green phase. Both phases showed a relatively high absorbance at 750 nm indicating the presence of BChlc therefore the presence of chlorosomes inthe supernatant. On the contrary, the supernatant from the washed with EDTA membranes showedonly characteristic peaks of carotenoids and cytochrome type c. The quality of the Tricine-SDS-PAGEof the supernatant from the procedure with EDTA was better regarding the resolution and the number of the separated protein bands. In addition, the total number of the identified proteins from the TricineSDS-PAGE of the supernatant from the procedure with EDTA was 106, while from the Tricine-SDSPAGE of the supernatant from the procedure with NaBr were 60. The vast majority of the identified proteins were soluble and mainly ribosomal proteins. In the case of NaBr we noticed the removal of several peripheral membrane proteins from their membrane complexes (like PscD from the RC) which will probably cause the instability or the inactivation of the membrane complexes. This is not preferable in a functional study of the membrane proteins. Another bottleneck for the proteomic analysis of the membranes of Chl. tepidum is the presence of chlorosomes which contain a huge amount of pigments that influence any electrophoretic analysis.We tried to isolate chlorosome-depleted membranes for the analysis of the membrane proteome ofChl. tepidum. The membranes were purified by sucrose density centrifugation and characterized byone-and two-dimensional electrophoresis (1-DE, 2-DE) coupled with mass spectrometry, absorptionspectroscopy and electron microscopy. 1-DE and 2-DE were employed to analyze the membraneproteins and to characterize the capabilities of the methods. At the same time, improvement of thesolubilization of the membrane proteins prior to 2-DE was accomplished using a series of witterionicdetergents. Based on the resolved spots after 2-DE, the combination of ASB-14 with Triton X-100 ismore efficient than the combination of CHAPS, SB 3-10 and Triton X-100. From the application of 1-DE and 2-DE, 167 and 202 unique proteins were identified respectively, using peptide massfingerprinting (PMF) by matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry(MALDI-TOF MS). Both methods resulted in the detection of 291 different proteins of which only 88were predicted membrane proteins, indicating the limitation of membrane proteins detection after separation with electrophoresis methods. In addition 53 of them were identified as outer membraneproteins indicating the close association of outer membrane proteins to the plasma membrane. We investigated protein-protein interactions in the membrane and soluble fraction of Chl. tepidum utilizing blue-native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE) in combination with 2-DBN/Tricine-SDS–PAGE and identification of the separated proteins by mass spectrometry. Thesoluble proteins and the chlorosomes were removed combining the treatment of the isolatedmembranes from Chl. tepidum with EDTA and NaBr, and the ultracentrifugation on sucrose gradientof the washed membranes, prior the functional study. Three major bands were separated, which were studied with visible spectroscopy and Tricine-SDS-PAGE. Chlorosomes were isolated in one band close to the top of the sucrose gradient, while the lower bands close to the bottom of sucrose gradient, which showed the lowest absorbance at 750 nm and the highest at 810 nm, was analyzed with ΒΝPAGE and 2-D BN/Tricine-SDS–PAGE. Comparing the ΒΝ-PAGE gels resulted from the different washing procedures of the membranes, was ascertain that except the different number of protein complexes (18 in NaBr and 17 in EDTA) the main difference is the existence of a wide protein band in the middle of the gel, with an apparent molecular weight of 232 kDa. This protein band consists mainly of the hypothetical protein Q8KBI3, which has been identified in every of our studies on the membranes of Chl. tepidum, and possess characteristics of an outer membrane protein. It seems to incur in at least two isoform, which form protein complexes with different size. In total, 33 different proteins were identified after ΒΝPAGE separation and MALDI TOF MS analysis. The majority of those proteins is membrane and is related with the energy metabolism. The GRAVY values of the majority of the proteins are similar with hydrophilic proteins with none or small hydrophobic regions in their amino acid sequence. From 2-D BN/Tricine-SDS–PAGE around 100 spots resulted from which 89 identified which corresponds to 120 different proteins. The GRAVY values of the majority of the proteins correspond to more hydrophobic proteins in regard with the proteins which were identified in 1-D BN-PAGE. The big subunit of RC of Chl. tepidum was identified in 8 protein complexes on the top of ΒΝ-PAGE gel. In 7 of them FMO protein was also identified. The apparent molecular weight of those complexes is in agreement with the calculated molecular weight of the RC complex (581 kDa). The subunits of RC, PscΒ, PscC and PscD were not detected in any complex in ΒΝ-PAGE, but the apparent molecular weight of the complexes in which PscA was identified, indicates the existence of the whole complex of RC. FMO protein seems to occur in different complexes with RC, either as two trimers or as one, and as one free trimer without the RC. The chlorosome-depleted membranes which resulted from sucrose gradient of the washed membranes were solubilized with DDM and analyzed with 1-D BN-PAGE. 24 protein complexesresulted in all three bands, from which 18 different proteins were identified. The GRAVY values ofthe majority of the proteins are similar with hydrophilic proteins with none or small hydrophobicregions in their amino acid sequence. From 2-D BN/Tricine-SDS-PAGE, 47 protein spots resultedfrom which 25 different proteins were identified by MALDI TOF MS. The GRAVY values of themajority of the proteins are similar with hydrophilic proteins. The subunits of the photosynthetic RC,PscA and PscC were identified in the 1-D gel but not in the 2-D. The RC of Chl. tepidum occurssolubilized in different intermediate complexes with apparent molecular weights between 400 and 800 kDa, which is in agreement with the bibliography. 2-D BN/Tricine-SDS-PAGE confirmed theascertainment from 1-D ΒΝ-PAGE, that the hypothetical proteins Q8KBI3 and Q8KE01 form amembrane complex. These proteins have similar molecular weight which makes their separation in the 2-D not possible. BN-PAGE of the soluble proteins of Chl. tepidum resulted the separation of 42 protein complexes from which 62 different proteins were identified by MALDI TOF MS. The combination of 1-D BN-PAGE with 2-D ΒΝ/Tricine-SDS PAGE obtained the separation of more than 200 protein spots out of which 188 different proteins were identified. 141 (75%) proteins of them were not identified in the 1-D BN-PAGE, a fact that indicates the necessity of 2-D ΒΝ/Tricine-SDS PAGE for the identification of all the proteins that participate in one protein complexes. Characteristic cytosolic protein complexes such as RNA polymerase and chaperonin were identified. In addition, proteins which have important roles in metabolism and in particular sulfur metabolism were identified significant evidences came up for their interaction with specific proteins. Globally, from the proteomic analysis that we realized in the Chl. tepidum identified in total 602 proteins from the 2,288 proteins that are predicted by the genome. This number constitutes the 26.31% of the theoretical proteome of Chl. tepidum. This is the first time that 109 hypothetical proteins areexperimentally identified, where the 39 from which they are conserved between various photosynthetic organisms and likely they play important role in the photosynthesis and more generally in photobiology.

To Chlorobium tepidum είναι ένα θερμόφιλο Gram-αρνητικό, πράσινο θειοβακτήριο (Chlorobia), είναι αποκλειστικά αναερόβιο φωτολιθοαυτότροφο και είναι ευρέως διαδεδομένο σε υδατικά περιβάλλοντα, όπου ανοξικά στρώματα που περιέχουν ανηγμένες ενώσεις θείου εκτίθενται σε φως. Προσφάτως, το γονιδίωμα του πράσινου θειοβακτήριου Chl. tepidum αναλύθηκε πλήρως αλλά η λειτουργία ενός μεγάλου αριθμού γονιδίων παραμένει άγνωστη. Πολλά γονίδια βρέθηκε ότι είναι υψηλά συντηρητικά μεταξύ των φωτοσυνθετικών οργανισμών με μη ξεκάθαρο ρόλο στο Chl. tepidum, αλλά αυτά τα γονίδια πιθανών να έχουν συγκεκριμένους ρόλους στην φωτοσύνθεση και στην φωτοβιολογία. Χαρακτηρισμός διαφόρων προϊόντων γονιδίων μπορεί να πραγματοποιηθεί με πρωτεομικές μεθόδους. Τα αντίστοιχα γονίδια μπορούν να ταυτοποιηθούν από την αλληλουχία του γονιδιώματος με προσδιορισμό της Ν-τερματικής αλληλουχίας της πρωτεΐνης ή με την χρήση μεθόδων ταυτοποίησης με φασματοσκοπία μάζας. Μία εκτεταμένη πρωτεομική προσέγγιση εξαρτάται από την δυνατότητα εμφάνισης και ανάλυσης διαφόρων πρωτεϊνών, συμπεριλαμβανομένων και των μεμβρανικών πρωτεϊνών, οι οποίες σπανίως ανιχνεύονται στην δύο-διαστάσεων ηλεκτροφόρηση (2-DE). Στην παρούσα εργασία αναπτύχθηκαν μέθοδοι για την πρωτεομική ανάλυση του υδατοδιαλυτού και μεμβρανικού μέρους του Chlorobium tepidum. Αρχικά, πραγματοποιήθηκε εμπλουτισμός των μεμβρανικών πρωτεϊνών του Chlorobium tepidum με απομόνωση των μεμβρανών. Οι απομονωμένες μεμβράνες διαλυτοποιήθηκαν με Triton X-100 και μετά από υπερφυγοκέντρηση, από το υπερκείμενο ταυτοποιήθηκαν με φασματοσκοπία μάζας 58 διαφορετικές πρωτεΐνες. Η χρήση του ιοντικού δωδεκυλoθειϊκού νατρίου (SDS) για τη διαλυτοποίηση των μεμβρανικών πρωτεϊνών σε συνδυασμό με καταβύθιση των πρωτεϊνών με ακετόνη, είχε ως αποτέλεσμα την βελτίωση του μοτίβο της 2-DE και την αύξηση των συνολικά ταυτοποιημένων πρωτεϊνών στις 117. Η καταβύθιση των πρωτεϊνών με ακετόνη βελτίωσε το αποτέλεσμα εκχυλίζοντας ενώσεις που επηρεάζουν την διακριτική ικανότητα της 2-DE. Όμως, η τιμή GRAVY των επιπλέον πρωτεϊνών που ταυτοποιήθηκαν από την χρήση του SDS δεν μπορούν να χαρακτηριστούν υδρόφοβες αλλά πρωτεΐνες που διαλυτοποιούνται δυσκολότερα. Στην συνέχεια έγιναν προσπάθειες επιλεκτικής εκχύλισης των πρωτεϊνών της εξωτερικής μεμβράνης χρησιμοποιώντας την μέθοδο της όξινης εκχύλισης. Το εκχύλισμα που προέκυψε αναλύθηκε με 2-DE και οι διαχωρισμένες πρωτεΐνες ταυτοποιήθηκαν με φασματοσκοπία μάζας. Συνολικά ταυτοποιήθηκαν 37 πρωτεΐνες από τις οποίες 14 προβλέφθηκε ότι περιέχουν σηματοδοτική αλληλουχία που δηλώνει την τοποθέτηση τους στο περιπλασματικό χώρο ή στην εξωτερική μεμβράνη. Η ταυτοποίηση ενός σημαντικού αριθμού υδατοδιαλυτών πρωτεϊνών, κυρίως ριβοσωμικών, στο μεμβρανικό κλάσμα του Chl. tepidum δείχνει την ανάγκη απομάκρυνσης τους από τις μεμβράνες πριν από οποιαδήποτε ανάλυση. Για αυτόν τον λόγο, οι απομονωμένες μεμβράνες του Chl. tepidum πλύθηκαν με δύο διαφορετικά αλάτια, το EDTA και το NaBr. Οι πλυμένες μεμβράνες και στις δύο περιπτώσεις συλλέχθηκαν με υπερφυγοκέντρηση. Το υπερκείμενο και οι μεμβράνες που προέκυψαν και από τις δύο διαδικασίες αναλύθηκαν με φασματοσκοπία απορρόφησης ορατού και Tricine-SDSPAGE, ενώ η συνολική ποσότητα πρωτεΐνης που περιέχουν προσδιορίστηκε με την μέθοδο Bradford. Η Tricine-SDS-PAGE και η μέθοδος Bradford έδειξαν ότι οι πλυμένες με EDTA μεμβράνες περιείχαν περισσότερες πρωτεΐνες από τις πλυμένες με NaBr μεμβράνες. Συνολικά, με την χρήση φασματοσκοπίας μάζας, 119 διαφορετικές πρωτεΐνες ταυτοποιήθηκαν από την Tricine-SDS-PAGE των πλυμένων με EDTA μεμβρανών, ενώ μόνο 93 διαφορετικές πρωτεΐνες ταυτοποιήθηκαν από την Tricine-SDS-PAGE των πλυμένων με NaBr μεμβρανών. Το υπερκείμενο στην περίπτωση των πλυμένων με EDTA μεμβρανών ήταν διαυγές με ελαφρύ κόκκινο-καφέ χρώμα, ενώ το υπερκείμενο στην περίπτωση του NaBr περιείχε δύο διακριτές φάσεις. Μία παχύρρευστη με βαθύ πράσινο χρώμα φάση και μία διαυγή με ελαφρύ πράσινο-λαδί χρώμα φάση. Και οι δύο φάσεις εμφάνισαν σχετικά υψηλή απορρόφηση στα 750 nm που δηλώνει την παρουσία BChlc. Αντίθετα, το υπερκείμενο από τις πλυμένες με EDTA μεμβράνες εμφάνισαν χαρακτηριστικές κορυφές που οφείλονται σε καροτενοειδή και κυτόχρωμα τύπου c. Η ποιότητα της Tricine-SDS-PAGE του υπερκείμενου από την διαδικασία με το EDTA ήταν καλύτερη όσον αφορά την διακριτική ικανότητα και τον αριθμό των διαχωριζομένων πρωτεϊνικών ζωνών. Επιπλέον, ο συνολικός αριθμός των ταυτοποιημένων πρωτεϊνών από την Tricine- SDS-PAGE του υπερκείμενου από την διαδικασία με το EDTA ήταν 106, ενώ στην περίπτωση του NaBr ταυτοποιήθηκαν 60 διαφορετικές πρωτεΐνες. Η πλειοψηφία των ταυτοποιημένων πρωτεϊνών ήταν υδατοδιαλυτές και κυρίως ριβοσωμικές πρωτεΐνες. Στην περίπτωση του NaBr παρατηρήθηκε η απομάκρυνση διαφόρων περιφερειακών μεμβρανικών πρωτεϊνών από τα μεμβρανικά τους σύμπλοκα (όπως η PscD από RC) η οποία πιθανών να προκαλεί την αστάθεια ή την απενεργοποίηση των μεμβρανικών συμπλόκων. Μεγάλο εμπόδιο στην πρωτεομική ανάλυση των μεμβρανών του Chl. tepidum είναι τα χλωροσώματα που περιέχουν έναν τεράστιο αριθμό χρωστικών που επηρεάζουν αρνητικά οποιαδήποτε ηλέκτροφορητική ανάλυση. Απομόνωση μεμβρανών που δεν περιέχουν χλωροσώματα επιτεύχθηκε με υπερφυγοκέντρηση σε διαβάθμιση πυκνότητας ζάχαρης. Οι απομονωμένες μεμβράνες χαρακτηρίστηκαν με μίας- και δύο- διαστάσεων ηλεκτροφόρηση (1-DE, 2-DE) σε συνδυασμό με φασματοσκοπία μάζας, φασματοσκοπία απορρόφησης ορατού και ηλεκτρονικό μικροσκόπιο. Βελτίωση της διαλυτοποίησης των μεμβρανικών πρωτεϊνών πριν από την 2-DE πραγματοποιήθηκε με την χρήση διαφόρων αμφοτερικών απορρυπαντικών. Βασιζόμενοι στον αριθμό των πρωτεϊνικών στιγμάτων που διαχωρίστηκαν από την 2-DE, συμπεραίνουμε ότι ο συνδυασμός του ASB-14 με το Triton X-100, είναι περισσότερο αποτελεσματικός από τον συνδυασμό των CHAPS, SB 3-10 και Triton X-100. Από την εφαρμογή της 1- και 2-DE, 167 και 202 διαφορετικές πρωτεΐνες ταυτοποιήθηκαν αντιστοίχως. Συνολικά, και από τις δύο μεθόδους ταυτοποιήθηκαν 291 διαφορετικές πρωτεΐνες από τις οποίες μόνο οι 88 προβλέφθηκε ότι είναι μεμβρανικές πρωτεΐνες που δηλώνει τα όρια του προσδιορισμού των μεμβρανικών πρωτεϊνών έπειτα από διαχωρισμό με ηλεκτροφορητικές μεθόδους. Επιπροσθέτως, 53 από αυτές, ταυτοποιήθηκαν ως πρωτεΐνες της εξωτερικής μεμβράνης, γεγονός που δηλώνει την στενή σχέση των πρωτεϊνών της εξωτερικής μεμβράνης με την κυτταροπλασματική μεμβράνη. Οι πρωτεϊνικές αλληλεπιδράσεις στο μεμβρανικό και το υδατοδιαλυτό κλάσμα του Chl. tepidum μελετήθηκαν χρησιμοποιώντας μη-αποδιατακτική ηλεκτροφόρηση σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου (BNPAGE), σε συνδυασμό με δύο-διαστάσεων ηλεκτροφόρηση (2-D BN/Tricine-SDSPAGE) και ταυτοποίηση των διαχωριζομένων πρωτεϊνών με φασματοσκοπία μάζας. Για την απομάκρυνση των υδατοδιαλυτών πρωτεϊνών και των χλωροσωμάτων από τις μεμβράνες, επιλέχθηκε ο συνδυασμός της κατεργασίας των απομονωμένων μεμβρανών του Chl. tepidum με EDTA και NaBr, και της υπερφυγοκέντρησης σε διαβάθμιση ζάχαρης των πλυμένων μεμβρανών, πριν από την λειτουργική μελέτη τους. Διακρίθηκαν τρεις κύριες ζώνες, ενώ συνολικά το αποτέλεσμα της διαβάθμισης ζάχαρης χωρίστηκε σε 9 ζώνες οι οποίες μελετήθηκαν με φασματοσκοπία ορατού και Tricine-SDS-PAGE. Τα χλωροσώματα απομονώθηκαν σε μία ζώνη ψηλά στην διαβάθμιση ζάχαρης ενώ οι ζώνες με την χαμηλότερη απορρόφηση στα 750 nm και την υψηλότερη στα 810 nm αναλύθηκαν με ΒΝ-PAGE και 2-D BN/Tricine-SDSPAGE. Συγκρίνοντας τις πηκτές ΒΝ-PAGE που προέκυψαν από τις διαφορετικές συνθήκες πλυσίματος των μεμβρανών διαπιστώνεται ότι εκτός από τον διαφορετικό αριθμό πρωτεϊνικών συμπλόκων (18 στο NaBr και 17 στο EDTA) η κύρια διαφορά είναι η ύπαρξη μιας ευρείας ζώνης πρωτεϊνικού συμπλόκου στο μέσο της πηκτής ΒΝ-PAGE με φαινομενικό μοριακό βάρος περίπου 232 kDa. Αυτή η πρωτεϊνική ζώνη αποτελείται κυρίως από την υποθετική πρωτεΐνη Q8KBI3, που έχει ταυτοποιηθεί σε όλες τις έως τώρα μελέτες μας στις μεμβράνες του Chl. tepidum, και έχει χαρακτηριστικά πρωτεΐνης της εξωτερικής μεμβράνης. Η πρωτεΐνη αυτή φαίνεται να υφίσταται σε περισσότερες από δύο ισομορφές οι οποίες σχηματίζουν διαφορετικού μεγέθους πρωτεϊνικά σύμπλοκα. Συνολικά ταυτοποιήθηκαν 33 διαφορετικές πρωτεΐνες μετά τον διαχωρισμό με ΒΝ-PAGE και ανάλυση με MALDI TOF MS. Η πλειοψηφία των ταυτοποιημένων πρωτεϊνών είναι μεμβρανικές και σχετίζονται με τον μεταβολισμό της ενέργειας. Οι τιμές GRAVY της πλειοψηφίας των πρωτεϊνών αντιστοιχούν σε πρωτεΐνες υδρόφιλες με μικρές ή καθόλου υδρόφοβες περιοχές στην αλληλουχία αμινοξέων τους. Από την 2-D BN/Tricine-SDSPAGE προέκυψαν περίπου 100 πρωτεϊνικά στίγματα από τα οποία ταυτοποιήθηκαν τα 89 που αντιστοιχούν σε 120 διαφορετικές πρωτεΐνες. Οι τιμές GRAVY της πλειοψηφίας των πρωτεϊνών αντιστοιχούν σε πρωτεΐνες πιο υδρόφοβες σε σχέση με αυτές που ταυτοποιήθηκαν στην 1-D BN-PAGE. Η μεγάλη υπομονάδα του RC του Chl. tepidum ταυτοποιήθηκε σε 8 πρωτεϊνικά σύμπλοκα στην κορυφή της ΒΝ-PAGE πηκτής. Σε 7 από αυτά τα σύμπλοκα ταυτοποιήθηκε και η FMO. Το φαινομενικό μοριακό βάρος των συμπλόκων αυτών συμφωνεί με το μοριακό βάρος του πρωτεϊνικού συμπλόκου του RC που έχει υπολογιστεί στα 581 kDa. Οι πρωτεΐνες του RC, PscΒ, PscC και PscD δεν ανιχνεύθηκαν με το MALDI TOF MS σε κανένα πρωτεϊνικό σύμπλοκο στην ΒΝ-PAGE, αλλά το φαινομενικό μοριακό βάρος των συμπλόκων στα οποία ταυτοποιήθηκε η PscA, συνηγορούν στην ύπαρξη ολόκληρου του φωτοσυνθετικού συμπλόκου του RC. Η πρωτεΐνη FMO φαίνεται να υφίσταται σε διάφορα σύμπλοκα του RC προσδεμένη πιθανότατα είτε ως δύο τριμερή είτε ως ένα τριμερές, αλλά και ως ελεύθερα τριμερή FMO. Οι μεμβράνες χωρίς χλωροσώματα που προέκυψαν από την διαβάθμιση ζάχαρης των πλυμένων μεμβρανών διαλυτοποιήθηκαν με DDM και αναλύθηκαν με 1-D BN-PAGE. Προέκυψαν περίπου 24 πρωτεϊνικά σύμπλοκα και στις τρεις ζώνες, από τις οποίες ταυτοποιήθηκαν 18 διαφορετικές πρωτεΐνες. Οι τιμές GRAVY της πλειοψηφίας των πρωτεϊνών αντιστοιχούν σε πρωτεΐνες υδρόφιλες με μικρές ή καθόλου υδρόφοβες περιοχές στην αλληλουχία αμινοξέων τους. Από την 2-D BN/Tricine- SDS-PAGE προέκυψαν περίπου 47 πρωτεϊνικά στίγματα που ταυτοποιήθηκαν με MALDI TOF MS και αντιστοιχούν σε 25 διαφορετικές πρωτεΐνες. Η πλειοψηφία αυτών προβλέφθηκε ότι είναι μεμβρανικές, ενώ οι περισσότερες από αυτές σχετίζονται με τον μεταβολισμό. Οι τιμές GRAVY της πλειοψηφίας των πρωτεϊνών αντιστοιχούν σε πρωτεΐνες υδρόφιλες. Οι πρωτεΐνες που αποτελούν το φωτοσυνθετικό RC, PscA και PscC ταυτοποιήθηκαν στην 1-D πηκτή αλλά δεν ταυτοποιήθηκαν στην 2η διάσταση. Το RC του Chl. tepidum υφίσταται διαλυτοποιημένο σε διάφορα ενδιάμεσα υποσύμπλοκα. Το φαινομενικό μοριακό βάρος αυτών των συμπλόκων μπορεί να εκτιμηθεί ότι είναι από 400 έως και 800 kDa που συμφωνεί με τα βιβλιογραφικά δεδομένα. Επιβεβαιώνεται με την 2-D BN/Tricine-SDS-PAGE η διαπίστωση από την 1-D ΒΝ-PAGE, ότι οι υποθετικές πρωτεΐνες Q8KBI3 και Q8KE01 συμμετέχουν στην δημιουργία ενός μεμβρανικού συμπλόκου. Οι πρωτεΐνες αυτές έχουν παραπλήσιο μοριακό βάρος με αποτέλεσμα τον μη διαχωρισμό τους στην 2η διάσταση. Η μεγαλύτερη ποσότητα αυτών των πρωτεϊνών φαίνεται να βρίσκεται σε μία ευρεία ζώνη με φαινομενικό μοριακό βάρος γύρω στα 40 kDa, ενώ στην ίδια κατακόρυφο ταυτοποιήθηκαν μικρότερα πρωτεϊνικά στίγματα της πρωτεΐνης Q8KBI3, με φαινομενικά μοριακά βάρη από 24-30 kDa. Τα αποτελέσματα αυτά συμφωνούν με τα αποτελέσματα της 2-D BN/Tricine-SDS-PAGE των πλυμένων μεμβρανών πριν από τη διαβάθμιση ζάχαρης. Από την BN-PAGE των υδατοδιαλυτών πρωτεϊνών του Chl. tepidum διαχωρίστηκαν 42 πρωτεϊνικά σύμπλοκα τα οποία αναλύθηκαν με MALDI TOF MS για την ταυτοποίηση των πρωτεϊνών. Συνολικά ταυτοποιήθηκαν 62 πρωτεΐνες οι πλειοψηφία των οποίων προβλέφθηκε ότι είναι κυτταροπλασματικές, ενώ οι περισσότερες από αυτές προβλέφθηκε ότι συμμετέχουν στον μεταβολισμό του κυττάρου. Η 1-D BN-PAGE συνδυάστηκε με την 2-D ΒΝ/Tricine-SDS PAGE για την διασαφήνιση της ταυτότητας των διαχωρισμένων πρωτεϊνικών συμπλόκων όσον αφορά την σύσταση των υπομονάδων. Ταυτοποιήθηκαν συνολικά 188 διαφορετικές πρωτεΐνες, από τις οποίες οι 141 (75%) δεν ταυτοποιήθηκαν στο 1-D BN-PAGE, γεγονός που ισχυροποιεί την αναγκαιότητα της 2-D ΒΝ/Tricine-SDS PAGE για την ταυτοποίηση όλων των πρωτεϊνών που συμμετέχουν σε ένα πρωτεϊνικό σύμπλοκο. Χαρακτηριστικά πρωτεϊνικά σύμπλοκα του κυτταροπλάσματος όπως είναι η RNA πολυμεράση και η σαπερονίνη (GroEL) ταυτοποιήθηκαν. Επίσης, πρωτεΐνες που διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στον μεταβολισμό και ιδιαίτερα στον μεταβολισμό του θείου ταυτοποιήθηκαν και προέκυψαν σημαντικές ενδείξεις για την αλληλεπίδραση τους με συγκεκριμένες πρωτεΐνες. Συνολικά, από την πρωτεομική ανάλυση που πραγματοποιήσαμε στο Chl. tepidum ταυτοποιήθηκαν συνολικά 602 πρωτεΐνες από τις συνολικά 2,288 πρωτεΐνες που προβλέπονται από το γονιδίωμα. Ο αριθμός αυτός αποτελεί το 26.31% του θεωρητικού πρωτεόματος του Chl. tepidum. Για πρώτη φορά ταυτοποιήθηκαν πειραματικά 109 υποθετικές πρωτεΐνες, οι 39 από τις οποίες είναι συντηρημένες ανάμεσα σε διάφορους φωτοσυνθετικούς οργανισμούς και πιθανών να παίζουν σημαντικό ρόλο στην φωτοσύνθεση και γενικότερα στην φωτοβιολογία.